小球藻中PHB提取优化

利用次氯酸钠和超声处理辅助化学预处理方法从小球藻中提取和优化聚羟基丁酸酯

摘要

食品包装的使用日益增加，导致塑料废物成为最严重的环境问题。由于传统塑料来源于化石聚合物，难以被细菌分解。合适的解决方案是用生物塑料替代。本研究采用小球藻作为聚‐β‐羟基丁酸酯（PHB）的生产者。PHB具有生物降解性、热塑性、疏水性、与细胞和组织的生物相容性，以及类似于聚丙烯的物理性质，因此在食品、制药和医疗包装中具有应用潜力。PHB通过从小球藻生物质中提取获得。本研究探讨了使用化学和机械细胞破碎方法（即次氯酸钠和超声处理）结合溶剂浓度变异的PHB提取方法。从小球藻中提取PHB最简单且经济的方法包括细胞破碎、PHB沉淀和PHB纯化等常规步骤。PHB的定量方法是通过计算PHB产率，然后使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对PHB进行鉴定，并通过气相色谱‐质谱（GCMS）测试最佳PHB化合物的质量。本研究使用的参数包括产率、PHB的物理结果以及PHB的测试结果。在样品浓度为0.6% w/v、溶剂浓度为1.37% w/v并采用超声处理的条件下，PHB提取的最佳产率达到37.2%。GCMS样品结果显示存在正十六烷酸（棕榈酸）、9‐十八碳烯酸（油酸）、2‐棕榈酰甘油和十八烷酸（硬脂酸）等主要化合物，这些化合物具有作为生物塑料材料的潜力。

关键词 ：次氯酸钠，聚羟基丁酸酯（PHB），溶剂萃取，小球藻，超声处理

引言

食品包装在分销链中对食品保鲜起着重要作用。食品包装的主要目的是保护食品免受污染并延长保质期。

然而，使用聚合物作为包装材料的问题在于其需要数百年才能降解。包装废弃物的不断积累和环境意识的增强促使人们需要开发可生物降解塑料。此外，合成聚合物也不具备可持续性，因为它们由不可再生的原材料（石油）制成，而石油目前正处于日益枯竭的状态。其中一个解决方案是使用可生物降解包装，以减少包装废弃物和石油衍生物的消耗[1]。

可生物降解塑料旨在促进细菌和真菌等微生物的酶反应降解过程[2]。这种可降解性是由于含有来自生物的天然聚合物（生物聚合物），这些天然聚合物通常可被微生物分解。常用于作为塑料原料混合物的天然聚合物包括多糖，如聚乳酸（PLA）、淀粉、木质素‐纤维素、果胶和来自木材、种子、块茎及其他蔬菜的壳聚糖[3]。此外，蛋白质和脂质通常来源于动物，可产生酪蛋白、胶原蛋白和明胶[1]。然而，将这些材料用作生物塑料的挑战在于它们本身是食品原料，可能与食物需求产生竞争。此外，由于包装具有延长食品保质期的功能，因此需要具备阻隔空气和水的性能，而这些成分具有亲水性，极易受到水的影响。

聚羟基丁酸酯（PHB）是一种满足生物降解性、热塑性、疏水性以及与细胞和组织具有良好生物相容性要求的聚合物，其物理化学性质与聚丙烯相似，但具有更优的生物降解性[4]。PHB可在多种生态系统中被许多微生物通过微生物同化作用降解为二氧化碳、甲烷、水、无机化合物或生物质。当微生物接触该聚合物时，会分泌酶将其分解为更小的连续片段，从而降低其平均分子量。PHB已被用于多种一次性产品和包装材料[5]。

异养细菌通过发酵过程生产商用聚羟基丁酸酯，该工艺产率较高（50%‐80%），但由于异养细菌需要更多的碳源、磷源和氧源，培养基成本较高[6]。已有研究发现，微藻小球藻可作为碳源和能量储存产物，合成属于脂肪族聚酯家族的完全可生物降解聚合物[7]。普通小球藻的蛋白质含量较高，占干重的51%–58%，脂肪含量占干重的14%–22%[8]。小球藻中较高的蛋白质和脂肪含量使其成为潜在的塑料替代材料，因为聚羟基丁酸酯正是以蛋白质和脂肪形式通过生物合成产生的化合物。

进一步研究提取方法将有助于优化从小球藻C. vulgaris.中获得的PHB产量和质量。PHB作为胞内产物被合成，因此基本步骤包括预处理以破坏细胞壁、沉淀从细胞中释放的PHB，以及PHB纯化。溶剂萃取法因其操作简单、可获得高纯度PHB，并适用于大规模生产且具有经济优势而被选用。第一步是采用次氯酸钠（NaClO）和超声处理进行细胞破碎预处理，该处理旨在溶解细胞壁和叶绿素，因为C. vulgaris具有厚细胞壁。

第二步是使用蒸馏水和甲醇作为溶剂沉淀PHB。第三步是用热氯仿对沉淀物进行纯化，然后再次用冷甲醇洗涤。通过离心收集沉淀的PHB。提取的聚合物随后采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行检测，以鉴定物质并利用气相色谱‐质谱（GCMS）分析PHB中化合物的特性。

本研究的重点是次氯酸钠溶剂浓度的变异，预期结果是确定用于产生最佳PHB产量的次氯酸钠细胞破碎剂溶剂的浓度比。同时观察了最有效的细胞分散步骤处理，以获得最高纯度的PHB，作为传统食品包装材料的替代品。

材料与方法

材料

聚羟基丁酸酯（PHB）生产的原料是来自中国西安赛阳生物科技有限公司生产的小球藻粉末，声称其蛋白质含量为52.58%。用于细胞破碎的溶剂是由马林克罗特化学公司生产的次氯酸钠（NaClO），浓度为5% w/v，购自日惹ARD化学商店。用于PHB沉淀的溶剂为默克公司生产的甲醇和蒸馏水。用于PHB纯化的溶剂为默克公司生产的氯仿。用于溶解PHB以便注入气相色谱‐质谱（GCMS）的溶剂为默克公司生产的正己烷。

基础实验工具来自印度尼西亚大学化学工程系生物过程工程实验室。超声处理使用埃尔马Sonic 30H，频率为53千赫兹。傅里叶变换红外光谱分析使用赛默飞世尔Nicole iS5系列，气相色谱‐质谱分析使用珀金埃尔默公司设备。

方法

聚-β-羟基丁酸酯的提取

将0.6克样品加入含次氯酸钠的细胞破碎剂溶剂中，在30°C下以53千赫兹超声处理20分钟，然后在室温（30°C）继续孵育1.5小时。孵育后，混合物在4000转/分钟离心15分钟，随后分别用蒸馏水和甲醇洗涤。洗涤后，沉淀物溶解于1 ml沸腾的氯仿中。将氯仿溶液浓缩至较小体积，加入1 ml冷甲醇，然后将样品冷藏过夜。通过离心收集析出的聚羟基丁酸酯[9]。

所使用的NaClO浓度变异为10% 体积比、25% 体积比和50% 体积比。这些变异通过将次氯酸钠用蒸馏水稀释制得。随后添加超声处理以帮助削弱小球藻的细胞壁，因为该微藻具有非常厚的细胞壁。超声处理还有助于溶解溶液，因此有望提高聚羟基丁酸酯的质量。

PHB 从小球藻中的定量

为计算聚羟基丁酸酯积累，先称量干生物量样品，然后再次称量分离样品[9]。

$$
\text{PHB accumulation} = \frac{\text{Dry weight of PHB extracted (g)}}{\text{Dry Cell Weight (g)}} \times 100
$$

小球藻中聚羟基丁酸酯的表征

提取过程完成后，采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）对提取的聚羟基丁酸酯（PHB）进行表征，以确定PHB样品中的化学基团，并将光谱与商用聚羟基丁酸酯的性质或其他科学期刊中报道的PHB结果进行比对。

通过红外光谱吸收分析，如表1所示，可以解读FTIR分析结果，并标注出重要的吸收峰。最重要的波数汇总于表1[10]中。该提取的PHB在印度尼西亚大学工程学院化学工程实验室进行了傅里叶变换红外光谱表征。

表1 红外光谱[10]总结

波数范围 (cm⁻1)	键类型
3550 – 3200	O-H
3000 – 2840	C-H
1740 – 1720	C=O
1662 – 1626	C=O
1650 – 1566	C=C
1420 – 1330	O-H
1275 – 1200	C-O
1075 – 1020	C‐O‐C

GCMS分析

从小球藻分离物中提取的聚羟基丁酸酯聚合物分析在气相色谱‐质谱仪器（珀金埃尔默公司）上进行，使用毛细管柱（HP5MS），30 m x 0.25 mm，即涂有DB‐5，0.25 μm膜厚；柱箱温度60 °C，流速 32.7mL/min，进样口温度250 °C，载气（氦气）恒定压力72.8kPa，流速1.20mL/min，采集参数为全扫描，扫描范围30至500道尔顿。将5毫克纯化的PHB溶解于20毫升氯仿中，并在100 °C加热至蒸发。然后，将样品的提取物溶解于20毫升正己烷中，并在70 °C加热。随后，取1微升注入GC‐MS仪器[11]。

结果与讨论

聚羟基丁酸酯 Chlorella vulgaris 的定量分析

次氯酸钠是一种常用的细胞破碎溶剂，常用于破坏细胞壁和微藻叶绿体，以在PHB提取步骤中获得高纯度产物，但必须谨慎选择次氯酸钠的浓度，因为聚羟基丁酸酯对次氯酸钠并非完全耐受[12]。超声处理旨在削弱细胞壁，因为小球藻具有厚细胞壁。本研究观察了NaClO浓度以及超声处理对所产PHB的质量结果和产率的影响，并获得了样品浓度的最佳对比方案以及溶剂。所用微藻生物量为0.6克，本研究中溶剂浓度的变异是将纯次氯酸钠5% w/v 的浓度稀释为三种不同浓度，如表2所示，并使用pH计进行pH计算。

表2. 次氯酸钠溶剂浓度的变异

变异	次氯酸钠体积（ml）	蒸馏水体积（ml）	次氯酸钠浓度	pH
CV I	10	90	0.55% w/v	11.77
CV II	25	75	1.37% w/v	12.3
CV III	50	50	2.74% w/v	12.63

测量总样品质量和PHB质量以计算每种溶剂浓度变异下的产率。图1显示了溶剂浓度与PHB产率之间的关系。

图1显示，随着溶剂浓度的增加，聚羟基丁酸酯（PHB）产量下降。结果表明，溶剂浓度与样品浓度之间的比较会影响PHB产量，需要予以考虑。在一定的次氯酸钠（NaClO）浓度下，NaClO会降解PHB，因为PHB不能完全抵抗NaClO的放热反应。然而，高浓度的溶剂也会增加生物质与溶剂之间的接触表面。这一结果解释了为何溶剂浓度为2.74% w/v的样品相比溶剂浓度较低的样品提取时产率更低。此外，pH值取决于NaClO浓度，较高的NaClO百分比会使pH值升高。NaClO是一种强碱，其pH> 11并能形成氢氧根离子（OH‐）。pH值影响PHB的降解，因为过碱性的pH值会破坏细胞质膜中酶的作用，并杀死微藻细胞。这表明，在特定浓度条件下若pH值过于碱性，则有可能导致PHB降解[13]。然而，提高溶剂浓度对PHB的物理外观有良好效果，如表3所示。

表3. 聚羟基丁酸酯的物理外观

变异	浓度样品	浓度溶剂	PHB的物理结果	超声处理	无超声处理
CV I	0.6% w/v	0.55% w/v
CV II	0.6% w/v	1.37% w/v
CV III	0.6% w/v	2.74% w/v

可以看出，样品中次氯酸钠浓度越高，溶剂溶解的叶绿素越多，因为溶剂与生物质之间的接触更加充分。该结果表明，如果次氯酸钠浓度远超过所用样品的浓度，聚羟基丁酸酯将发生更严重的降解；反之，若次氯酸钠浓度过低，则导致聚羟基丁酸酯物理性质较差。这是因为在调整样品和溶剂浓度时，才能实现有效的性能分离。表4显示了超声处理对聚羟基丁酸酯产率的影响。

表4. 在溶剂浓度变异下使用超声处理对聚羟基丁酸酯产率的影响百分比

变异	产率(%) 超声处理	产率(%) 无超声处理	产量下降百分比 超声处理	产量下降百分比 无超声处理	产率通过超声处理提升(%)
CV I	46.40 ± 0.69	41.02 ± 0.71	–	11.6
CV II	45.65 ± 0.85	37.2 ± 0.61	1.61	9.3	18.5
CV III	21.88 ± 0.73	14.95 ± 0.89	52.84	63.55	31.68

CV I与CV II之间的变异下降百分比较CV III更小。在使用超声处理的情况下，PHB产率的下降百分比显示CV I和CV II明显低于CV III。样品浓度与溶剂浓度的比值影响了产率浓度。从结果可以看出，如果溶剂浓度高于样品浓度，会导致更多的聚羟基丁酸酯产量降解，从而减少最终产率。可以看出，经过超声处理的样品其产率百分比下降更多，因为该过程会产生热量。当溶剂浓度比高于样品浓度时，容易破坏样品。此过程有助于溶解溶液，使生物质与溶剂之间的接触面积大于常规情况，导致更多细胞破裂，进而降低产率。

因此，对于CV III溶剂而言，若使用超声处理，则无法有效获得最佳产率。然而，超声处理可以改善聚羟基丁酸酯的质量结果，如表3所示。聚羟基丁酸酯的物理结果显示了一种颜色较浅。这是因为每个生物质颗粒与溶剂的接触达到最大，使得更多的叶绿素溶解在次氯酸钠中，留下PHB颗粒。因此可以看出，超声波在CV II样品中的应用是有效的，因为其产率下降百分比较小，且能得到物理性质良好的PHB。然而，其在大规模PHB提取过程中的应用还需进一步评估，因其在大规模生产中可能展现出更好的潜力。

该结果需要被考虑以选择样品与溶剂浓度之间的适当比例。在本研究中，CV II 样品经超声处理后表现出最佳结果。随后，对该样品进行傅里叶变换红外光谱和GCMS分析表征。

聚羟基丁酸酯小球藻的鉴定 Chlorella vulgaris

提取的聚羟基丁酸酯随后在印度尼西亚大学工程学院化学工程实验室通过傅里叶变换红外光谱进行表征。光谱结果如图2所示。

以表格形式总结时，傅里叶变换红外光谱的峰可与聚羟基丁酸酯化学结构中存在的键相对应（图3），如表5所示。

表5. 利用傅里叶变换红外光谱鉴定聚羟基丁酸酯中的官能团

波数范围 (cm⁻1)	键类型	透射率百分比
1634.04	C=O（羰基）	82.22
1020.89	C‐O‐C（单体之间的酯键）	45.7
2926.51	–CH（主基团中的碳）	98.01
3286.56	–OH (羧基)	92.43
2164.76	–N₃ (叠氮基)	76.69
2022.70	双键酯	77.89

1020.89 cm⁻¹、1634.04 cm⁻¹ 和 2926 cm⁻¹ 处的谱带分别代表 C‐O‐C 键、C=O 键和 –CH 键，与小球藻属中发现的聚羟基丁酸酯（1025 cm⁻¹、1625 cm⁻¹ 和 2920 cm⁻¹）相似。随后，3286 cm⁻¹ 处的波数显示了 –OH 键，几乎与小球藻属在 3339 cm⁻¹[14] 处的显著峰相近。本研究中，2164.76 cm⁻¹ 处的峰代表由样品中蛋白质引起的叠氮基团，而 2022.70 cm⁻¹ 处的波数显示双键酯。然而，峰值所在波长与其他聚羟基丁酸酯文献中的相似性表明，该提取过程从小球藻成功获得了聚羟基丁酸酯。

GCMS分析

GCMS 表征旨在通过将鉴定出的化合物光谱与威利09数据库中的光谱进行比较，以确定分离样品中的化合物。它可以确认样品是否为聚羟基丁酸酯，并找出主要的化合物是可生物降解聚合物，具有作为生物塑料的潜力。如果相似性指数越接近100%，则表明鉴定出的化合物越接近标准化合物。

对从FTIR样品中获得的PHB提取物进行GCMS分析的结果显示，在表6中列出了九种不同的化合物，其相似性指数均达到或超过60%。

表6. 通过GCMS分析揭示的小球藻可生物降解聚合物的化学组成

S/N	保留时间 (min)	总百分比	化合物名称	分子量	分子式
1	18.4	0.82	正癸酸	172.26	C₁₀H₂₀O₂
2	23.77	0.76	十四烷酸	228.37	C₁₄H₂₈O₂
3	25.50	0.99	棕榈酸甲酯	270.5	C₁₇H₃₄O₂
4	26.03	36.31	正十六烷酸	256.42	C₁₆H₃₂O₂
5	27.81	32.88	9‐十八碳烯酸	282.5	C₁₈H₃₄O₂
6	27.99	6.18	十八烷酸	284.5	C₁₈H₃₆O₂
7	28.72	0.31	棕榈酸乙烯酯	282.5	C₁₈H₃₄O₂
8	29.22	10.58	2‐棕榈酰甘油	330.5	C₁₉H₃₈O₄
9	29.39	1.4	己二酸, 癸基异丁酯	342.5	C₂₀H₃₈O₄

获得的主要化合物为正十六烷酸，占总量的36.31%，是含量最高的化合物，分子量256.42克/摩尔；其次是 9‐十八碳烯酸，占总量的32.88%；然后是2‐棕榈酰甘油，占总量的10.58%；以及十八烷酸，占总量的6.18%。

化合物正十六烷酸，通常称为棕榈酸，是存在于动物、植物和微生物中最常见的饱和脂肪酸类别，可作为植物代谢物、Daphnia magna代谢物以及藻类代谢物[15]。这表明样品中存在聚羟基丁酸酯。棕榈酸是一种脂肪族聚合物酯，属于可生物降解的脂肪族聚酯家族，因为这种酯键可以被水解[16]。该化合物常用于制造肥皂、润滑油、防水剂、食品添加剂及其他化学品。假设棕榈酸被释放到环境中，该酸会进入颗粒物中，最终沉降到地面，并被微生物分解，因此不会产生残留物。由于其环保特性，在生物塑料领域具有巨大的应用潜力。在本样品中另一主要鉴定出的化合物是9‐十八碳烯酸，通常称为油酸，属于长链脂肪酸的一类。油酸是一种天然存在于多种动物和植物脂肪及油中的脂肪酸，与其他脂肪酸类似。它不以游离状态存在，通常以甘油酯（如甘油三酯）或长链醇酯的形式存在[17]。随后，2‐棕榈酰甘油的作用是作为源自正十六烷酸的藻类代谢物[18]。最后，十八烷酸，通常称为硬脂酸，是一类饱和脂肪酸，可从动物和植物脂肪中获取并加以利用。硬脂酸可用于制造生物塑料，提供防潮屏障和抗菌性能，因为它能够降低生物塑料薄膜的水蒸气透过率[19]。因此，这些化合物的存在表明聚羟基丁酸酯有潜力被用作生物塑料材料。

结论

使用次氯酸钠进行溶剂萃取是从小球藻中提取聚羟基丁酸酯的一种简单而有效的方法。在细胞分散步骤中加入超声处理可提高PHB产量的质量，但更适合大规模操作。所选的溶剂浓度为1.37% w/v，样品浓度为0.6% w/v，因其产率相对较高且纯度高。PHB产量下降是由于溶剂浓度增加所致。溶剂浓度与样品之间的比较高时，会增加生物质与溶剂之间的表面接触，从而导致更多的聚羟基丁酸酯被降解。来自小球藻的聚羟基丁酸酯在性质及其所含化合物方面具有成为生物塑料材料的潜力。然而，仍需进一步开发和优化提取方法，以适应工业规模的应用。