原核表达｜蛋白表达｜大肠杆菌蛋白表达

一、服务概述

在分子生物学与蛋白工程研究中，原核表达系统（尤其是E.Coli表达系统）以其高效、经济、操作简便的优势，成为最常用的蛋白表达平台之一。

原核表达蛋白服务，即从基因合成、载体构建、表达优化、蛋白纯化、质量检测到功能验证的完整流程。

1. 原核表达系统开发与载体构建

在蛋白原核表达过程中，选择合适的表达系统是成功的关键。首先需要针对目标蛋白进行密码子优化，提高其在大肠杆菌等宿主中的翻译效率。常见的原核表达载体（如pET、pGEX、pBAD等）可搭配不同的融合标签（如His、FLAG、HA、Strep、CBP、GST、MBP、SUMO等），并且可以整合多种酶切位点，便于后续纯化和功能研究。

不同的宿主菌株（如BL21(DE3)、Rosetta、Origami、C41等）中，大肠杆菌蛋白表达效率有明显不同。例如，BL21(DE3)适用于可溶性蛋白的高效表达，而C41/C43菌株更适合膜蛋白或易形成表达蛋白包涵体的蛋白。因此，需分析蛋白特性（如分子量、疏水性、毒性等）制定高效原核表达的技术方案。

1. 蛋白表达条件优化及放大

对于原核表达蛋白，通过优化诱导条件（如IPTG浓度、温度、时间），可提高蛋白的可溶性和活性。对于易形成包涵体的蛋白，可以采用表达蛋白包涵体处理策略，如梯度复性、分子伴侣辅助折叠等，用于恢复其天然构象和活性。

在放大生产时，从摇瓶培养（1-5L）逐步放大至发酵罐（20L-2,000L），优化溶解氧、pH值及补料方案，确保重组蛋白表达的稳定性和可重复性。

1. 蛋白纯化与质量分析

原核表达纯化流程通常采用多步层析策略，例如亲和层析（如Ni-NTA纯化His标签蛋白），分子筛层析（SEC）去除聚集体和离子交换层析（IEX）提高纯度等。

质量控制方面，主要有：SDS-PAGE/Western blot 检测纯度和特异性；质谱分析验证序列正确性；生物活性检测功能完整性。

此外，还可以进行缓冲液优化、蛋白冻干等下游处理，以满足不同应用需求。

常见问题（FAQ）

Q1：原核表达系统有什么特点？

A:原核表达系统（如大肠杆菌）是常用的重组蛋白生产平台，具有成本低、周期短、易操作等优势，但存在缺乏翻译后修饰、易形成包涵体等局限性，适合表达结构简单的蛋白。

Q2：His标签蛋白表达如何优化？纯化时要注意什么？

A:优化包括密码子优化、诱导条件（温度/IPTG浓度）调整；纯化时需注意咪唑浓度梯度洗脱、避免金属离子污染，必要时结合分子筛层析提高纯度。

Q3：如何解决原核表达中包涵体问题？

A:可通过低温诱导（16-25℃）、融合可溶性标签（如MBP、SUMO）、共表达分子伴侣提高可溶性；若仍形成包涵体，需采用变性-复性策略恢复蛋白活性。

Q4：原核表达载体如何选择？（如pET、pGEX等）

A:根据需求选择：

pET系列：强T7启动子，适合高表达

pGEX系列：带GST标签，利于可溶性表达

pBAD系列：阿拉伯糖诱导，精细调控表达水平

Q5：原核表达的蛋白活性如何检测？

A:需通过SDS-PAGE/Western blot验证表达，SEC检测均一性，并采用功能实验（如酶活、结合实验）确认活性。