免疫组化 (IHC) 操作步骤 + 注意事项！| MedChemExpress (MCE)

免疫组织化学 (Immunohistochemistry，IHC)，一种用于检测组织切片中特定抗原或蛋白质的方法。以已知的抗体为探针，与组织或细胞中的特定抗原 (如多肽、蛋白质等) 进行特异性的结合。随后，利用化学反应将这些抗原-抗体复合物进行可视化，从而实现对未知抗原在组织或细胞中的定性、定位甚至定量研究。

图 1. 免疫组织化学 (IHC) 原理图。

IHC 检测可分为直接法 (又称一步法) 和间接法 (二步、三步或多步法)。直接检测方法是直接与偶联物 (例如荧光染料、酶、胶体金或生物素) 结合标记的一抗的一步过程。直接法快速，但对于检测常规处理的组织中的大多数抗原缺乏足够的灵敏度 (图 2)。

图 2. 直接和间接免疫组织化学 (IHC) 方法[1]。

为了满足灵敏度更高的抗原检测的需求，Coons 等人开发了一种两步法。第一层抗体未标记，而第二层抗体 (针对一抗而产生) 则被标记 (图 2)。

 间接法的灵敏度高于直接法： 

未标记的一抗保留了完全的亲和力，具有更强的抗原结合力，并且每分子一抗的标记物（例如过氧化物酶）数量更多，从而增加了反应强度。

• 间接法可以用较少的一抗检测较少量的抗原，用于放大一抗信号，因为一个一抗至少可以结合两个带标记的二抗。

• 间接法也比直接法更方便，因为相同的二抗可用于检测不同的一抗，前提是后者是在同一物种中产生的。

IHC 实验流程：通常包括样本固定、包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染、封片观察 12 个部分。

图 3. 免疫组化（IHC）流程图[2]。

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样本固定

目的

1) 充分保存细胞成分，包括可溶性和结构性蛋白质；

2) 防止细胞成分 (包括抗原和酶) 自溶和置换；

3) 稳定细胞材料，避免后续程序产生有害影响；

4) 便于常规染色和免疫染色[1]。

甲醛是常规组织学和免疫组织化学固定剂的金标准。甲醛主要保存肽和细胞器的一般结构。

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基本步骤：

1）取材：从动物或人体取得所需的组织样本。对于组织块，要确保其大小适中，不宜过大，以便于固定液能够充分渗透。

2）初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水或 PBS 进行冲洗，以去除这些可能影响固定效果的物质。

3）固定：将组织样本放入固定液中。常用的固定液包括 10% 中性缓冲福尔马林 (Formalin，也称为甲醛)、甲醇、乙醇或它们的混合液等。固定液的量通常为组织体积的 10-20 倍，以确保组织能够充分浸入固定液中。大组织标本应切开固定，以免中间部分自溶解腐败。

☑ 固定时间根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间室温 18-24 h。

4）固定后的处理：固定完成后，将组织从固定液中取出，用流水冲洗数分钟，以去除残留的固定液和可能产生的结晶。

 注意事项：

• 固定的时间不宜过长，以免导致组织过度硬化和抗原性的丧失。

• 固定的温度通常为室温或 4°C，避免高温导致组织损伤。

• 在固定过程中，要确保组织样本完全浸入固定液中，避免出现未固定的部分。

• 固定的容器应干净、无杂质，避免对组织造成污染。

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包埋

目的

保护和支撑组织样本，以便在切片时保持其完整性。通过将组织样本嵌入到固体介质中，可以制作出适合在显微镜下观察的薄切片。

常用的包埋介质包括石蜡、树脂等。石蜡包埋是免疫组化中最常用的方法，因为它可以有效保存组织形态，提升切片质量。树脂包埋则常用于需要更高分辨率或特殊染色方法的样本。

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基本步骤：

1）脱水：在组织