71、山楂叶黄酮对 RAW264.7 细胞蛋白质组的影响及基于云计算的计算机支持协作学习平台构建

山楂叶黄酮对 RAW264.7 细胞蛋白质组的影响及基于云计算的计算机支持协作学习平台构建

山楂叶黄酮对 RAW264.7 细胞蛋白质组的影响

山楂叶黄酮是从山楂植物叶片中分离得到的淡棕色粉末，略带苦涩味。现代药理学研究通过大量动物实验证实，山楂叶黄酮具有调节血脂、抗血栓、降血压、增加心肌耐氧能力、抗炎和镇痛等作用，但其作用机制尚不清楚。

实验材料与方法

• 材料 ：RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病）细胞由奥地利格拉茨生化研究所提供。山楂叶黄酮（批号：100845 - 200501）购自上海海蟾生物技术有限公司。丙烯酰胺、亚甲基双丙烯酰胺等试剂购自 GE 医疗公司。
• 方法
  1. MTT 比色法 ：将 RAW264.7 细胞接种于 96 孔板，在含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基中培养，分别用不同浓度（20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml）的山楂叶黄酮处理 24 小时，设置对照组和空白组。然后加入 MTT 孵育 4 小时，去除上清液，加入 DMSO 溶解结晶，在 570nm 波长处检测吸光度值。
  2. 细胞质蛋白提取 ：将 RAW264.7 细胞传代培养于 24cm²培养瓶中，处理组细胞在含 60μg/mL 山楂叶黄酮的 10%胎牛血清培养基中培养 24 小时，对照组细胞在 10%胎牛血清培养基中培养。培养后收集细胞，用适量细胞裂解液在 4℃裂解 60 分钟，超声处理 150 秒，冰浴中每 10 秒间隔 10 秒。然后在 4℃以 12000g 离心 30 分钟，收集上清液，用 2D - Quant 试剂盒测定蛋白浓度，提取的蛋白储存于 - 80℃备用。
  3. 二维电泳（2 - DE）与可视化 ：将 300μg 蛋白质与水化溶液混合至总体积 450μl，置于 24cm 的 Immobiline Dry 胶条（pH 4 - 7，24cm）上，进行等电聚焦（IEF），条件为 30V 12 小时、500V 1 小时、1000V 1 小时、8000V 8 小时。IEF 后，胶条立即平衡两次，每次 15 分钟，然后转移到预制的 12.5% SDS - 聚丙烯酰胺凝胶上，用 Ettan DALTsix 进行 SDS - PAGE，5W/胶条 45 分钟，15W/胶条直至溴酚蓝迁移至凝胶底部。分离后的蛋白质通过灵敏的银染法进行可视化。
  4. 凝胶成像与分析 ：用 UMAX ImageScanner 凝胶扫描仪（GE 医疗，美国）以 300 像素/英寸的分辨率扫描可视化凝胶图像，通过 ImageMaster 2D Plantinum 6.0 图像分析软件（GE 医疗，美国）对凝胶上的斑点进行识别、匹配、去除和差异蛋白分析。
  5. 蛋白质消化与质谱鉴定 ：分离检测后，从丙烯酰胺凝胶中分离出感兴趣的蛋白质，用 Milli - Q 水洗涤两次。制备的样品用 50μl 脱色液（50mmol/L Na₂S₂O₃，15mmol/L K₃Fe(CN)₆）脱色，用 Milli - Q 水洗涤三次，再用 100μl 25mmol/L NH₄HCO₃ 洗涤一次，振荡 8 分钟后去除。凝胶斑点用 100μl 乙腈脱水 8 分钟，加入 100μL 含 10nmol/L DTT 的 25mmol/L NH₄HCO₃ 在 57℃还原蛋白质 1 小时，冷却至室温，去除多余液体，立即加入 100μl 含 55mM 碘乙酰胺的 25mmol/L NH₄HCO₃ 在室温下使蛋白质烷基化 1 小时。然后凝胶斑点再次用 100μl 乙腈脱水，冻干后加入三倍体积的 12.5ng/μl 胰蛋白酶（Sigma，美国）溶液在 37℃消化 7 - 8 小时。用 50μl 45% H₂O/5% TFA/50% 乙腈提取肽段两次，在 SpeedVac（Thermo Savant，美国）中冻干，用基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱仪（4800 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems，美国）进行分析。通过肽质量指纹图谱（PMFs）和肽片段化模式结合 Mascot 搜索引擎在 NCBI 非冗余数据库中进行蛋白质鉴定。

实验结果

• 细胞形态观察 ：在显微镜下观察 RAW264.7 细胞，发现细胞大小均匀，边界清晰，大多呈圆形或纺锤形，细胞核居中，可用于实验研究。
• 山楂叶黄酮对 RAW264.7 细胞增殖的影响 ：用不同浓度的山楂叶黄酮处理 RAW264.7 细胞 24 小时，通过 MTT 法检测细胞相对活力。结果表明，当山楂叶黄酮浓度大于或等于 80µg•mL⁻¹ 时，对细胞生长有显著抑制作用，因此选择 60μg.mL⁻¹ 的浓度来研究山楂叶黄酮对 RAW264.7 细胞蛋白质组的影响。
• 差异蛋白质组分析与质谱鉴定 ：通过二维电泳和银染获得 RAW264.7 细胞和经山楂叶黄酮处理 24 小时的细胞的蛋白质组图谱，用 ImageMaster 2D 6.0 软件分析。选择在 RAW264.7 细胞和处理细胞中蛋白表达量差异超过 2 倍的 16 种差异表达蛋白质，用基质辅助激光电离飞行时间质谱（MALDI TOF MS + MS / MS）进行鉴定，相关信息如下表所示：

Match ID	蛋白质名称	MW	PI	Score	用药后变化
231	真核翻译起始因子 3	36437.6	5.38	271	下调
233	异柠檬酸脱氢酶 3（NAD⁺）	39588	6.47	189	下调
329	β - 肌动蛋白	39160.6	5.78	165	下调
225	磷酸甘油酸激酶 1	44510	8.02	250	下调
272	M2 型丙酮酸激酶	57744	7.15	120	下调
79	视网膜母细胞瘤结合蛋白	47760.2	4.89	129	下调
62	动力蛋白激活蛋白	44089.7	5.14	178	下调
191	原肌球蛋白调节蛋白	39478.3	5.02	223	下调
46	含 TCP1 的伴侣蛋白	59585.9	5.72	303	下调
318	F - 肌动蛋白	30609.4	5.69	79	下调
246	核仁磷酸蛋白	32539.8	4.61	197	上调
420	泛素结合酶 E2N	17127	6.13	362	上调
278	未知蛋白	40992.5	5.56	294	上调
87	泛醇 - 细胞色素 c 还原酶核心蛋白 1 前体	52818.5	5.81	91	上调

实验讨论

实验结果显示，山楂叶黄酮处理后，真核翻译起始因子 3、异柠檬酸脱氢酶 3、β - 肌动蛋白等蛋白质的表达下降，而核仁磷酸蛋白、泛素结合酶 E2N、泛醇 - 细胞色素 c 还原酶核心蛋白 1 前体等蛋白质的表达增加。磷酸甘油酸激酶 1（PGK1）和丙酮酸激酶（PK）在糖酵解过程中起重要作用，与肿瘤的发生发展高度相关。异柠檬酸脱氢酶 3 是柠檬酸循环中的重要限速酶。山楂叶黄酮降低了这三种酶的表达，表明它可能通过调节能量代谢来抑制肿瘤细胞的生长。真核翻译起始因子（eIFs）是真核细胞蛋白质翻译所必需的一类蛋白质，eIF - 3 参与细胞生长和细胞周期调节。山楂叶黄酮下调 eIF - 3 的表达，表明它可以调节细胞内蛋白质的合成，从而抑制细胞增殖。微丝作为细胞骨架的一部分，与细胞的抗剪切力、维持细胞形态以及参与细胞分裂和运动有关。细胞实验表明，山楂叶黄酮处理后这些蛋白质的表达下降，表明山楂叶黄酮可能通过抑制细胞分裂和增殖来影响细胞结构。

基于云计算的计算机支持协作学习平台构建

目前，计算机支持的协作学习工具存在扩展缓慢、内容传递系统简单等问题，缺乏技术和教育技术的具体培训，给教师带来了困难。本文提出了一种基于云计算技术的方法，旨在解决现有 ESCOLE 原型平台的一些问题，如缺乏子空间概念、事件管理服务僵化、无图形工作流模型、编辑受限、工作流延展性差等。

平台需求与逻辑架构

• 支持教师和学生学习 ：教师的教育发展可以采取不同形式。新手教师可以直接通过观察过程（会议）了解教育、技术和实际问题，也可以通过阅读报告和最佳实践目录、与专家和其他教师交流间接学习。之后，观察者可以开始参与集体学习活动的定义和设计，最终可以指导活动，帮助经验更丰富的教师。
• 提供专业共享空间 ：教师和专家认为教育空间应用于共享所有准备、评估和讨论项目。教育空间包括一个层次工程子空间。为学习过程的每个组织者设置一个生产空间，学生在该空间执行集装箱堆场规定的集体活动，通常在教师的控制下。必要时，生产空间可以分为不同类别的专业子空间或小组。参与者（教师和学生）可以在个人电脑提供的私人空间中完成个人工作。
• 提供基本协作工具和 CSCL 工具 ：平台应提供基本协作工具集，包括生产工具（如共享编辑器、文档共享设施）、通信工具（如电子邮件、新闻、论坛、聊天、维基）和协调工具（如共享日历、投票设施）。当然，在私人空间中，所有参与者可以继续使用他们喜欢的生产工具。此外，学习会话使用不同类型的同步 CSCL 工具，这些工具要么专门用于特定任务，要么是通用的，即通过明确的学习过程模型进行参数化。与基本协作工具不同，CSCL 工具依赖于明确的学习理论，如创造皮亚杰的社会认知冲突或参与符合维果茨基思想的知识生产社会过程。
• 提供主动帮助和指导 ：由于角色和情况的多样性，学习活动不能局限于一些预定义的教育项目结构或一般的合作模式。平台应通过对更完整的工作流模型的解释，为教师和学生提供主动帮助和指导。这一过程与虚拟校园平台类似，但有所不同，中国的时间同步通常涉及大型集体学习过程，包括松散耦合的合作任务，学生和教师仅共享文件。例如，一个过程可以分析和综合每个学生的发展能力，评估初始能力（如通过撰写一些复杂文档的概要），第二步是集装箱堆场会议，使用同步论证工具学习相同的文本。在新的个人过程结束时，对每个学生的集体论证进行生产效率评估总结。平台必须支持混合集体学习过程。

通过以上两个方面的研究，一方面深入探讨了山楂叶黄酮对 RAW264.7 细胞蛋白质组的影响及其潜在的抗肿瘤机制，为中药的临床应用提供了理论基础；另一方面提出了基于云计算的计算机支持协作学习平台的构建方法，有望解决现有平台的一些问题，促进协作学习的发展。

山楂叶黄酮对 RAW264.7 细胞蛋白质组的影响及基于云计算的计算机支持协作学习平台构建（续）

基于云计算的计算机支持协作学习平台构建（续）

改进生产平台的设计与实现

为了解决 ESCOLE 原型平台存在的问题，设计了一个改进的生产平台。这个平台依托 Library Source（www.libresource.org），它是一个开源的分布式协作环境的工作流引擎扩展，由研究团队自主创建。同时，引入了通用工具 Omega +，它适用于合作学习情境、交互、过程和效果这四个维度的集装箱堆场模型，并提供图形建模工具，以增强平台的功能。

以下是改进生产平台的主要设计要点和实现步骤：
1. 子空间概念的引入 ：在平台中明确划分出不同的子空间，包括教育空间、生产空间、专业子空间和私人空间等。这种划分使得教师和学生能够更清晰地组织和管理学习资源和活动。例如，教育空间用于共享教育相关的准备、评估和讨论项目；生产空间为学习过程的组织者提供了执行集体活动的场所；专业子空间则可以根据不同的学习需求和专业领域进行细分；私人空间则满足了参与者个人工作的需求。
2. 图形工作流模型的建立 ：利用 Omega + 工具提供的图形建模功能，为平台创建直观的工作流模型。通过图形化的界面，用户可以更方便地设计、编辑和管理学习活动的流程。这不仅提高了工作流的可操作性，还增强了工作流的延展性，使得平台能够适应不同的学习场景和需求。
3. 事件管理服务的优化 ：对事件管理服务进行优化，使其更加灵活和智能。平台能够根据不同的学习活动和用户需求，自动调整事件的处理方式和流程。例如，在集体学习活动中，平台可以根据学生的参与情况和学习进度，自动分配任务和资源，提高学习效率。
4. 集成 CSCL 工具 ：将各种 CSCL 工具集成到平台中，为教师和学生提供丰富的协作学习支持。这些工具包括同步论证工具、知识构建工具等，它们基于明确的学习理论，能够帮助学生更好地参与学习过程，促进知识的生产和共享。

下面是一个简单的 mermaid 流程图，展示了改进生产平台的主要工作流程：

graph LR
    A[用户登录] --> B[选择学习空间]
    B --> C{学习空间类型}
    C -->|教育空间| D[共享项目资源]
    C -->|生产空间| E[执行集体活动]
    C -->|专业子空间| F[进行专业学习]
    C -->|私人空间| G[完成个人工作]
    D --> H[使用 CSCL 工具协作]
    E --> H
    F --> H
    G --> I[使用个人工具工作]
    H --> J[提交学习成果]
    I --> J
    J --> K[平台评估与反馈]

平台的优势与应用前景

通过上述改进，基于云计算的计算机支持协作学习平台具有以下显著优势：
1. 灵活性和扩展性 ：平台的子空间概念和图形工作流模型使得它能够轻松适应不同的学习场景和需求。无论是小型的小组学习还是大型的集体学习活动，平台都能够提供有效的支持。同时，平台的开源特性和分布式协作环境也为其扩展性提供了保障，未来可以方便地集成更多的工具和功能。
2. 支持知识构建 ：平台提供的 CSCL 工具基于明确的学习理论，能够帮助学生更好地参与知识生产和共享的社会过程。通过合作学习和交互，学生能够培养批判性思维、团队合作能力和创新能力，促进知识的构建和内化。
3. 提高学习效率 ：平台的事件管理服务和主动帮助指导功能能够根据学生的学习情况和需求，自动调整学习资源和任务分配，提供个性化的学习支持。这有助于提高学生的学习效率，减少学习时间和成本。
4. 促进教师专业发展 ：平台为教师提供了一个学习和交流的平台，教师可以通过观察其他教师的教学过程、参与集体学习活动的设计和指导等方式，不断提升自己的教育技术和教学能力。同时，平台也为教师提供了一个分享教学经验和最佳实践的机会，促进教师之间的专业交流和合作。

基于这些优势，该平台在教育领域具有广阔的应用前景。它可以应用于各种教育场景，如学校教育、职业培训、在线学习等，为教师和学生提供一个高效、便捷的协作学习环境。同时，平台的开源特性也使得它能够在不同的教育机构和组织之间进行共享和推广，促进教育资源的公平分配和共享。

总结

本文围绕两个重要主题展开了深入研究。一方面，通过实验研究了山楂叶黄酮对 RAW264.7 细胞蛋白质组的影响，揭示了其可能的抗肿瘤机制，为中药的临床应用提供了理论依据。另一方面，提出了基于云计算的计算机支持协作学习平台的构建方法，解决了现有平台存在的一些问题，为教育领域的协作学习提供了一个更加高效、灵活的解决方案。

未来，我们可以进一步深入研究山楂叶黄酮的作用机制，探索其在肿瘤治疗中的应用潜力。同时，不断完善基于云计算的计算机支持协作学习平台，引入更多的先进技术和工具，提高平台的性能和用户体验，为教育事业的发展做出更大的贡献。