DuraGraft保护大隐静脉移植物

冠状动脉旁路移植术中大隐静脉移植物的术中保存

摘要

生理盐水与大隐静脉移植物不具生物相容性，且无法防止缺血再灌注损伤。我们通过体外和离体实验比较了普通肝素化生理盐水与新型移植物保存液DuraGraft对细胞和血管移植物组织的影响。

方法 ：人源大隐静脉（HSV）段和分离的猪乳腺静脉（PMVs）经冲洗后，分别浸入肝素化DuraGraft或肝素化生理盐水，并在预先规定的时间内进行暴露。暴露后，对HSV段进行存活率和组织形态的评估，对PMVs进行组织学评估，以评价静脉形态及其对血管内皮细胞的影响。通过符合ISO标准的细胞毒性生物相容性检测，比较生理盐水与DuraGraft的性能。

结果 ：接触生理盐水后15分钟即可观察到HSV移植物细胞活力丧失，而使用DuraGraft暴露长达5小时仍可维持细胞活力。对PMVs进行的组织学分析显示，储存在生理盐水中的PMVs出现内皮损伤。细胞毒性检测表明，生理盐水引起的显微镜下可见的细胞损伤在60分钟内发生。经DuraGraft处理的细胞未显示出损伤或反应性的证据。

结论 ：生理盐水导致血管内皮损伤、移植物细胞活力丧失以及介导的细胞损伤；DuraGraft暴露细胞未观察到损伤或反应性的证据。

关键词 ：冠状动脉旁路移植；大隐静脉移植物；静脉移植物病变；移植物失效

1. 引言

大隐静脉移植物（SVGs）是冠状动脉旁路移植术（CABG）中非左前降支冠状动脉区域最常使用的血管桥。与动脉移植物相比，由于静脉移植物病变（VGD）及其继发的失败，SVGs的长期通畅性受到损害[1,2]。早期移植物失效发生在手术后一个月内，主要归因于手术相关技术问题或流变学问题[3–5]。晚期失效发生在CABG手术30天后，甚至可达十年或更久，其原因是缺血再灌注损伤（IRI）导致的静脉移植物病变[6,7]，表现为内膜增生伴粥样斑块形成、狭窄或血栓形成[8]。由于治疗失败的移植物比治疗闭塞的原生冠状动脉更为复杂、昂贵且成功率较低[9]，必须重点关注预防移植物失效。

尽管静脉移植物失效机制尚未完全明确，但静脉移植物病变（VGD）在旁路手术移植后的主要促进因素是术中损伤，这种损伤发生在血管移植物获取和处理过程中[10–12]。尽管这些操作过程中可能对移植物造成损伤，VGD仍被视为一种缺血‐再灌注损伤（IRI）相关疾病，因此必须保护离体的血管桥免受缺血性损伤，以降低VGD风险[7]。需要使用能够直接干预缺血性损伤主要机制（即氧化损伤和代谢应激）的溶液，以避免对移植物内皮造成功能性和结构性损伤。来自PREVENT IV的一项亚组分析表明，与其他因素相比，使用不合适的移植物保存液（如生理盐水和血液基溶液）所造成的损伤与12个月静脉移植物失效的相关性最高（p < 0.001）[10,11]，这并不令人意外，因为这些溶液无法防止缺血‐再灌注损伤[6,7]。

缺血‐再灌注损伤在缺血事件期间通过氧化损伤和代谢应激启动[13–15]。初始缺血性损伤使细胞和组织处于更易受损的状态，其损害效应仅在再灌注时显现[16]。即刻的再灌注效应包括促血栓形成和促炎反应。因此，对缺血器官或组织的再灌注并不能恢复其正常功能，反而会加剧缺血期间已发生的损伤[13,15]。这些早期再灌注阶段对损伤的反应会造成静脉移植物进一步损伤，从而持续放大损伤反应循环，构成静脉移植物病变进展的基础。针对缺血性损伤的再灌注损伤不仅发生在初始再灌注阶段，还可能在延长的再灌注阶段长期存在，其严重程度与初始缺血性损害的程度相关[17]。

保存液的主要作用是在移植物储存期间通过减轻缺血性损伤来防止缺血‐再灌注损伤（IRI）（器官获取组织协会；www.aopo.org/wikidonor/organpreservation/）。保存液通过干扰介导缺血性损伤的一个或两个机制来实现这一目的[18]。含有抗氧化剂的保存液可减少由活性氧，其在缺血期间由细胞（包括内皮细胞）和组织释放。内皮细胞特别容易受到活性氧的损伤[19]，因此，在器官或内皮保存液中添加抗氧化剂对于防止器官和/或内皮存活率和功能丧失至关重要。保存液还应与所保护的组织具有生物相容性，以避免缺血性损伤因‘溶液损伤’而加重。生理盐水（含有钠离子和氯离子）和缓冲溶液（仅含少量电解质）不属于保存液，因为它们不含任何能够干预缺血性损伤的成分。此外，已有研究表明生理盐水与组织不相容[20–24]可能导致‘溶液损伤’，从而在缺血性损伤的基础上进一步加重损伤。

DuraGraft®（SOMVC001；索马鲁申，佛罗里达州朱庇特）是一种专门设计的血管通路保存液，可作为预防缺血‐再灌注损伤（IRI）并在获取与移植之间保护大隐静脉移植物（SVGs）结构和功能完整性的有前景的替代方案[25]。在本研究中，为了进一步验证DuraGraft的保护作用，我们报告了猪静脉和人源大隐静脉（HSV）在生理盐水或DuraGraft中进行离体模型缺血保存的结果，以及一项体外细胞毒性研究。肝素化生理盐水作为最常用的移植物保存液，被选为DuraGraft的对照[26]。

2. 方法

2.1. 猪乳腺静脉评估

从两只家养雌性杂交猪中分别采集的两对乳腺静脉样本，立即用肝素化生理盐水（0.9%氯化钠）或肝素化DuraGraft溶液冲洗并浸没。其中一对静脉浸没保存45分钟，另一对保存24小时。随后，乳腺静脉样本在中性缓冲甲醛中进行组织固定，用磷酸盐缓冲液冲洗后置于70%乙醇中。静脉获取及组织固定由Basi公司，印第安纳州芒特弗农（PRO.1542–16,061）根据良好实验室规范进行，并送往Histo‐Scientific研究实验室（弗吉尼亚州芒特杰克逊），在那里进行处理、石蜡包埋、切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色，或按如下所述进行免疫组织化学评估。每份静脉样本共评估四个横截面H&E染色及每种免疫染色（CD31、血管性血友病因子（vWF）和caspase‐3）。对于每张染色切片，评估约15 − 28个高倍视野。实际评估的视野数量取决于染色横截面的周长，周长范围从直径为2 mm横截面的6.3 mm到直径接近4 mm静脉横截面的12.6 mm：每次分析对每段静脉的四个不同横截面共评估60至112个视野。所有组织学染色和病理学评估均按照良好实验室规范进行。

2.2. CD31、血管性血友病因子和caspase‐3的免疫组织化学染色

染色使用了来自两只动物的乳腺静脉组织切片。三组玻片用二甲苯脱蜡，并通过一系列酒精浴进行再水化。玻片用蒸馏水冲洗后，浸入啮齿类脱封闭液（Biocare，RD913）中。使用BioCare脱封闭舱进行热诱导抗原修复。冷却至室温后，采用IP FLX过氧化物酶（Biocare，IPB5000）和背景抑制剂（BioCare，BP974M）对组织进行封闭。其中一组玻片加入抗CD31抗体（Abcam，ab28364），按1:50比例稀释，在室温下孵育1小时；第二组玻片加入抗vWF抗体（Dako，A0082），按1:300比例稀释，在室温下孵育1小时；第三组玻片加入抗半胱天冬酶‐3抗体（Abcam，ab13847），按1:500比例稀释，在室温下孵育2小时。所有一抗均使用兔抗啮齿类HRP聚合物（BioCare，RMR622L）在室温下标记30分钟，并用IP FLX DAB（BioCare，IPK5010）显色。

2.3. H&E染色和显微评估

固定后的乳腺静脉样本经过处理，包埋于石蜡中，切片并采用标准技术进行H&E染色。当存在H&E切片的显微镜下发现时，根据变化的强度和变化范围，主观地按0到4的等级进行评分：0表示无变化，1表示最小变化，2表示轻度变化，3表示中度变化，4表示显著变化。针对三种标记物的免疫染色切片，按照染色的分布和强度进行评估：0表示无染色，1+表示弱染色，2+表示中度染色，3+表示强染色。

2.4. 大隐静脉段的活力检测

根据批准的人体研究子委员会方案并在知情同意后，从在波士顿退伍军人医疗保健系统接受冠状动脉旁路移植术的九名不同男性患者（n = 9）（平均 ±标准差年龄67.1 ± 9.8岁）中术中采集大隐静脉段。在将静脉段置于肝素化生理盐水或肝素化DuraGraft中保存15分钟至5小时之前，未对其进行扩张或操作。轻柔地切除多余的脂肪组织和外膜，并使用荧光‐评估内皮细胞的活力基于−活/死检测试剂（Calcein AM/侐廷宁单体；分子探针，伊图溪，佛罗释州）通过将人隐静脉与Calcein AM和侐廷宁单体染料（10 mol/L，fi终浓度）在1.5 ml Hanks游离盐类溶液（pH 7.4）中于21℃孵育30分钟。孵育后，组织段在其相应的储存溶液中洗涤三次，并置于多光子显微镜的成像室载物台上，按如下所述进行成像。60分钟时间点的显微照片此前已发表[25]，并经出版商许可再次呈现。

2.5. 多光子成像

成像采用与锁模钛:萨菲尔激光器（谱泽物理公司，山景城，加加里约州）耦合的生命技术公司MRC 1024ES多光子成像系统（生命技术公司，赫克斯，加加里约州），该激光器工作重复频率为82 MHz，脉冲持续时间为80飞秒，波长调谐至820纳米，在透射和表面莱光模式下进行。使用配备高品质水浸 40×/1.2 NA、C‐消色差物镜的Zeiss Axiovert S100 倒置显微镜（卡尔·藏旟公司，成木山，纽约州）对 HSV区域进行成像并定量荧光。图像以直接检测模式采集，像素分辨率为0.484 m，采用Kalman 5 采集滤波器。通过 XYZ扫描确定每个HSV区域的管腔和内皮细胞层，并在纵向静脉片段中不同深度多次成像，通常深度为50至200 m，具体取决于静脉大小以及距切除部位 μm的位置。

2.6. 细胞毒性检测

细胞毒性研究基于国际标准化组织 10993‐5 的要求进行，即“医疗器械的生物学评价 – 第5部分：体外测试细胞毒性”，并在符合ISO 13485认证的质量管理体系下依照良好实验学规范进行。研究设计如图1所示。

L‐929 小鼠成纤维细胞（ECACC 目录号 85103115，细胞毒性研究的标准）在含有最低必需培养基 [MEM] 的培养瓶中进行传代和培养。将三十六个 10 cm2 孔接种后，在 37℃ 和 5% 二氧化碳（CO2）条件下孵育，以获得使用前的亚融合单层细胞。

DuraGraft，根据制造商’的说明制备，以及生理盐水（0.9%盐水）作为本研究的受试物质。实验时，移除细胞培养基，并用2 mL各自的处理分组溶液短暂清洗细胞：DuraGraft（12孔）、生理盐水（12孔）或对照溶液 1×MEM（12孔）。弃去清洗液后，加入2 mL DuraGraft、生理盐水或 1× MEM，将细胞在37℃下孵育30分钟、1小时、5小时或24小时。每个样本/时间点均设三个复孔。在每个时间点，对细胞进行裂解率、胞浆内颗粒消失和形态变化的评估，并根据表1所示的分级系统进行评分。评估后，移除处理溶液，更换为2 mL 1×MEM，在37℃、5% CO2条件下恢复 24 ± 2小时（恢复期）。恢复期结束后，再次在显微镜下观察细胞，并按照表1中描述的分级系统进行评分。对于在恢复期前因裂解导致细胞丢失的情况，还评估了被溶解细胞的再生能力。

3. 结果

3.1. 猪乳腺静脉的离体分析

在H&E染色下，将分离的猪乳腺静脉分别在肝素化DuraGraft溶液中保存45分钟和24小时后，其内膜、中膜和外膜的形态学表现正常（图2(a)）。乳腺静脉在DuraGraft溶液中保存时，在两个时间点均显示内皮细胞对内皮细胞表面标志物CD31和vWF呈弥漫性强免疫染色（图3(a,c,e)）；免疫染色在静脉切片的内皮层上连续分布。尽管在肝素化盐水溶液中保存45分钟的乳腺静脉经H&E染色评估也表现为正常形态学表现（数据未显示），但其细胞对CD31（图3(b)）和vWF的免疫染色模式呈弥漫性，且较DuraGraft保存的静脉染色较弱。到24小时时，生理盐水保存的乳腺静脉出现内皮细胞的多灶性聚集，并呈现斑片状内皮缺失，但中膜和外膜仍保持正常形态学表现（图2(b)）。CD31和vWF染色与DuraGraft保存的静脉相比呈弥漫性且较弱（图3(d,f)）；染色亦呈斑片状，免疫组化切片中可见部分区域存在内皮缺失及内皮细胞聚集，这与H&E染色所观察到的结果一致。无论是DuraGraft保存还是生理盐水保存的静脉，在45分钟或24小时时间点均未检测到caspase‐3染色阳性。

生理盐水 中保存 24小时 后的苏木精和伊红染色。箭头指向内皮层。分别评估了 DuraGraft 和生理盐水保存的静脉各四个横截面，每个横截面在血管周长范围内跨越 15 − 28个高倍视野 进行评估。显微照片为使用 40 ×倍物镜放大倍数拍摄的代表性图像。)

DuraGraft保存的静脉；(b) 生理盐水保存的静脉。24小时时CD31染色：(c) DuraGraft保存的静脉；(d) 生理盐水保存的静脉。24小时时血管性血友病因子染色：(e) DuraGraft保存的静脉；(f) 生理盐水保存的静脉。箭头指向内皮层，星号标记管腔位置。每组DuraGraft和生理盐水保存的静脉各评估四个横截面，每个横截面沿血管周长评估 15 − 28个高倍视野。显微照片为使用 40 ×物镜放大倍数拍摄的代表性图像。)

3.2. HSV中的分子活力检测

如先前所示，大隐静脉段在用肝素化生理盐水冲洗并保存1小时后，细胞活力显著丧失，而暴露于DuraGraft数小时后，细胞活力仍得以维持（图4(a,b)）[25]。与此发现一致，本研究表明，大隐静脉段在暴露于生理盐水仅15分钟后即出现显著的细胞活力丧失（数据由Hemant Thatte博士提供）（图4(c)），并在生理盐水中缺血保存30分钟内几乎完全丧失存活率（图4(d)）。每个所述时间点均展示了一张代表性显微照片。

DuraGraft或(b)生理盐水中保存1小时，以及在生理盐水中保存(c) 15分钟或(d) 30分钟后，采用基于荧光的活死细胞染色试剂染色的代表性多光子显微图像。DuraGraft和生理盐水组均收集并评估了九个片段（来自9名患者）。绿色荧光表示细胞活力，红色荧光表示非活细胞，黄色染色表示活细胞与死细胞的叠加。EC，内皮细胞。使用 40 ×物镜放大倍数拍摄的代表性显微照片。（图4(a,b) 转载自参考文献 25，塔特等人，2003年；经爱思唯尔许可）。)

3.3. 细胞毒性评估

暴露于DuraGraft或生理盐水30分钟之后，显微镜下未见细胞毒性证据（表2）。在暴露60分钟后，所有三个重复样本中暴露于生理盐水的细胞有30%被溶解（2级），且在24小时恢复期内未能恢复（表3）。相比之下，无在暴露60分钟后，DuraGraft暴露细胞中观察到细胞病变效应，且所有重复样本中均无裂解或反应性证据（表2）。暴露5小时后，90%的生理盐水暴露细胞发生裂解（4级），三个重复样本中的细胞单层几乎完全或完全破坏（表2），且在24小时后未见恢复（表3）。相比之下，DuraGraft暴露细胞在5小时时无裂解或反应性证据。暴露24小时后，生理盐水暴露细胞在全部三个重复样本中均100%被溶解（4级），而DuraGraft暴露细胞在三个重复样本中仅表现出轻微反应性（1级），伴有10%裂解（表3）。

表2。暴露后的细胞反应性和分级。
Well	变百圆分比	百分比细胞胞质颗没内粒有的	百裂分解比	等级反应性
30分钟
DuraGrafta	0	0	0	0	None
生理盐水a	0	0	0	0	None
MEM对照 a	0	0	0	0	None
60分钟
DuraGrafta	0	0	0	0	None
生理盐水a	30	30	30	2	Mild
MEM对照 a	0	0	0	0	None
5小时
DuraGrafta	0	0	0	0	None
生理盐水a	90	90	90	4	严重
MEM对照 a	0	0	0	0	None
24小时
DuraGrafta	10	10	10	1	轻微
生理盐水a	NA	NA	100	4	严重
MEM对照 a	0	0	0	0	None

使用表1 所示的分级系统对细胞在暴露于DuraGraft、生理盐水或 MEM组织培养基对照后30分钟、60分钟、5小时和24小时的测试评分进行展示。a每个暴露/时间点的三个重复培养均进行了评分，由于每次结果相同，仅显示一组结果。MEM：最低必需培养基；NA：不适用。

表3。 24小时恢复期后的细胞反应性和等级。
Well	百分比变圆	百分比细胞without胞质内的颗粒	百分比裂解	等级反应性
24小时恢复（初始暴露30分钟）
DuraGrafta	0	0	0	0	None
生理盐水a	0	0	0	0	None
MEM对照a	0	0	0	0	None
24小时恢复（初始暴露60分钟）
DuraGrafta	0	0	0	0	None
生理盐水a	30	30	30	2	Mild
MEM对照a	0	0	0	0	None
24小时恢复（初始暴露5小时）
DuraGrafta	10	10	10	1	轻微
生理盐水a	90	90	90	4	严重
MEM对照a	0	0	0	0	None
24小时恢复（初始暴露24小时）
DuraGrafta	10	10	10	1	轻微
生理盐水a	NA	NA	100	4	严重
MEM对照a	0	0	0	0	None

使用表1 所示的分级系统对细胞在暴露于DuraGraft、生理盐水或 MEM组织培养基对照后24小时恢复后的评分结果进行展示。a每个暴露/时间点的三个重复培养均进行了评分。由于每次结果相同，仅展示一组结果。MEM：最低必需培养基；NA：不适用。

4. 讨论

孤立的大隐静脉移植物（SVGs）是冠状动脉旁路移植术（CABG）中用于非左前降支冠状动脉区域最常用的血管桥，在近95%的冠状动脉旁路移植术中使用，但其长期通畅性可能受到静脉移植物病变的影响，且与动脉移植物相比耐用性较差[1]。旁路手术移植后静脉移植物病变的主要促进因素是术中损伤，这种损伤发生在血管移植物获取和处理过程中[10–12]。尽管术中移植物损伤可能是多因素导致的，但PREVENT IV试验的一项亚组分析发现，移植物保存液这一单一独立变量与12个月静脉移植物失效的相关性最高（p < 0.001）[10]。作者得出结论认为，移植物保存液在冠状动脉旁路移植术后移植物失效的发展中起着关键且重要的作用，并强调了适当移植物保护以及移植物保存液的重要性在防止术中移植物损伤方面，甚至可能对其造成损害。

在器官移植中，保存液用于在移植前维持器官的存活率，这在很大程度上涉及对缺血事件期间引发的缺血‐再灌注损伤的保护[13–15]。初始缺血性损伤使细胞和组织处于进一步损伤的易感状态，其效应仅在再灌注时显现[16]。因此，随后的再灌注并不能恢复正常的生理状态，反而会加重缺血期间已发生的损伤[13,15]。针对缺血性损伤的再灌注损伤既发生在初始再灌注阶段，也长期存在于prolonged reperfusion阶段，其严重程度与初始缺血性损害的程度相关[17]。

在冠状动脉旁路移植术（CABG）中，静脉移植物病变（VGD）是缺血‐再灌注损伤（IRI）的临床表现，由再灌注后对受损移植物内皮的反应所引发[6,7]。因此，应尽一切努力预防术中内皮损伤，包括使用适当的移植物保存液。保存液通过干预缺血性损伤介导的一个或两个机制（氧化损伤和代谢应激）发挥作用[13–15,18]。例如，含有抗氧化剂的保存液可减少在缺血期间由细胞和组织释放的活性氧引起的氧化反应。内皮细胞特别容易受到活性氧的损伤[19]，因此内皮保存液中含有抗氧化剂对于防止缺血期间内皮存活率和功能的丧失至关重要。保存液还应与其所保护的组织具有良好的生物相容性，以避免“溶液损伤”加重缺血性损伤。因此，有必要评估保存液的生物相容性。

肝素化生理盐水作为最常用的血管移植物保存[26]，在目前的研究中被选为DuraGraft的对照。生理盐水不含任何可预防或减轻氧化损伤或代谢应激的成分，因此无法防止缺血性损伤。而DuraGraft则专为血管移植物的保护设计，是一种含有抗氧化剂以减轻氧化损伤，并含有葡萄糖、精氨酸和高能磷酸盐以减少缺血期间代谢应激的离子和pH平衡溶液。

选择猪乳腺静脉（PMVs）作为离体模型，是因为其在大小和结构上与人隐静脉（HSV）相似。分离的PMVs在生理盐水或DuraGraft中储存45分钟后，H&E染色显示其具有正常形态学表现，但在内皮标志物的免疫组织化学染色上存在差异；与DuraGraft储存的静脉相比，生理盐水储存的静脉CD31和vWF染色强度较弱，表明这些特异性内皮细胞表面蛋白的表达水平低于DuraGraft储存的静脉。尽管H&E染色显示静脉的细胞和组织形态正常，但免疫组织化学结果提示，在生理盐水中暴露45分钟后已发生分子层面的损伤。免疫组织化学试剂——即用于检测特异性内皮细胞表面蛋白存在的分子染料——可用于检测分子水平的扰动，包括表达水平的变化，这通常是最早出现的改变。

功能障碍或细胞内部问题的指标。而H&E染色则提供了细胞和组织结构更高层次的信息。正常细胞和组织形态的丧失反映了高级组织结构的破坏，只有在发生足够的分子损伤后才会出现。

在24小时时，经DuraGraft保存的静脉在H&E染色中仍表现为形态学正常，而经生理盐水保存的静脉则表现异常，出现一些损伤，包括内皮细胞的多灶性聚集以及内膜缺乏内皮细胞的斑片状区域。内皮细胞的免疫组织化学染色结果与H&E染色一致。经DuraGraft保存24小时的乳腺静脉中，两种免疫组织化学试剂均显示出强、弥漫且连续的染色，表明内皮完整。然而，在暴露24小时后，生理盐水造成的严重损伤在免疫组织化学和H&E染色中均有明显证据。经生理盐水保存的大隐静脉段使用CD31和vWF试剂进行免疫组织化学染色时呈现斑片状且着色强度减弱，提示内皮细胞丢失和/或CD31或vWF表达显著降低。在经生理盐水暴露24小时的免疫组织化学染色切片中还观察到内皮细胞成团聚集的现象。

一个关键问题是，在45分钟内发生了多少损伤？这一点尤为重要，因为血管移植物根据手术的复杂程度，通常在保存液中存放30分钟至2−3小时。为了回答这一问题，使用caspase‐3特异性免疫组织化学试剂对PMVs进行染色。caspase‐3参与细胞死亡的颗粒酶B凋亡通路，阳性染色表明细胞已‘走向死亡’通过细胞凋亡途径[27]。然而，无论是生理盐水暴露的PMV还是DuraGraft暴露的PMV，均未显示caspase‐3阳性染色，表明这些PMVs中颗粒酶B凋亡通路不太可能处于激活状态。然而，还存在其他‘注定的死亡通路’，包括颗粒酶A凋亡和坏死通路[27]。确定这些通路是否在PMVs中激活的研究超出了本工作的范围。

采用双染色试剂进行分子活力检测，以进一步阐明在生理盐水与DuraGraft中储存的静脉段所发生的损伤程度。Calcein AM是一种非荧光性酯酶底物，仅可通过活性转运过程进入活细胞。一旦进入细胞内，细胞内酯酶会切割Calcein AM，生成绿色荧光的切割产物。因此，绿色荧光染色等同于活细胞，而死细胞不会产生荧光。溴化乙锭同源二聚体是一种膜不可渗透的红色荧光染料，只能通过细胞膜破损进入并染色死细胞。先前已证明，人隐静脉段在暴露于DuraGraft（即GALA）5小时后仍能保持细胞活力、正常结构和功能，而在生理盐水中仅储存60分钟的大隐静脉段其细胞活力几乎完全丧失[25]（图4(a,b)）。为了更明确地界定生理盐水暴露导致细胞活力丧失所需的最短时间，将人隐静脉冲洗后置于肝素化生理盐水中储存15或30分钟（图4(c,d)）。大隐静脉细胞存活率的丧失暴露于生理盐水仅15分钟就出现了存活率下降。黄色是双染色细胞叠加的结果，代表HSV区域中活细胞和死细胞的混合。到30分钟时几乎检测不到细胞活力，表明在生理盐水暴露30分钟内就发生了显著的活力丧失。综合来看，存活率和组织学数据表明，在暴露于生理盐水后15分钟内即发生显著的细胞死亡，该过程不涉及caspase‐3，但细胞和组织形态学的变化直到稍晚才能被检测到。

在缺血性HSV模型中观察到的存活率下降以及在PMV模型中观察到的内皮细胞损伤，鉴于生理盐水无法防止缺血性损伤，这并非完全出乎意料。生理盐水由于其酸性pH（5.5）和缺乏离子平衡，可能还会产生主动的‘溶液损伤’。生理盐水造成组织损伤的潜在危害可能通过大量相关报道得到证实[22–25,28–35]，这些报道范围广泛，涵盖了生理盐水作为冲洗液、润湿剂或组织保存液、玻璃体内注射溶液、复苏液，甚至作为人体活检组织在固定前短期保存液时所产生的有害作用。Sengupta等人报告了生理盐水的作用可模拟病理学表现，包括轻度发育异常、基底变性和假性白斑的表现[21]。他们总结道：‘绝不能以任何方式使用生理盐水，即使是短时间，来储存和运输切除的组织；必须立即将此类[活检组织]放入合适的固定剂如10%福尔马林中’。基于这些观察到的有害作用，大量文献特别指出，即使是短期暴露（10分钟），也会发生生理盐水介导的血管移植物损伤，这也就不奇怪了[23–25]。

将组织或器官暴露于生物相容性受损的溶液中可能会导致组织直接受损。溶液的生物相容性会受到物理特性（包括pH、渗透压和/或离子平衡）的影响，或受到溶液成分介导的细胞毒性的影响。生物相容性受损且无法防止氧化损伤，这与保存液所需具备的特性背道而驰。监管机构要求在注册前根据ISO 10993标准和FDA生物相容性指南2016[36,37]对保存液的生物相容性进行评估。因此，我们进行了细胞毒性评估以评价其生物相容性。ISO细胞毒性检测用于帮助预测医疗器械及其他医疗产品与人类组织的不相容性。啮齿类动物成纤维细胞系L‐929细胞已被验证并获ISO专家认可，适用于该检测。

细胞毒性评估虽然未达到统计学显著性的检验效能，但提示DuraGraft在暴露24小时后仍与测试细胞具有生物相容性，而生理盐水则具有细胞毒性。在暴露60分钟后，30%暴露于生理盐水的细胞已被溶解，且该百分比在暴露5小时后上升至约90%。有趣的是，在暴露30分钟后的恢复期内，那些外观正常的、尚未被溶解的生理盐水暴露细胞无法分裂以恢复细胞单层的汇合度，表明尽管在显微镜下分析时外观相对正常，但这些细胞已严重受损或死亡。L929细胞的倍增时间为14小时[38]而正常细胞应在24小时内恢复细胞汇合度。

本研究结果表明，生理盐水在暴露15分钟后即可导致分子损伤和细胞活力丧失。在生理盐水中储存45分钟的大隐静脉段中，CD31和vWF水平下降，且这些细胞在30分钟暴露后无法分裂，这与已发生显著分子损伤并导致细胞死亡的情况一致。这种损伤直到后期才在细胞形态上显现出来。鉴于暴露于生理盐水15分钟内即发生细胞损伤和存活率下降，可以认为目前植入的相当一部分大隐静脉移植物（此前曾暴露于生理盐水）在植入时已处于次优状态，甚至可能已严重受损或死亡。植入后，由于再灌注会加重损伤，预期将造成进一步损害。

我们的结果表明，DuraGraft在猪和人类缺血的离体模型以及细胞毒性评估中均表现出良好的细胞保护作用。这些结果还凸显了生理盐水的有害作用，并与其他已发表的研究中关于生理盐水对组织损伤作用的结论一致。临床上，这些数据具有重要意义，特别是考虑到大隐静脉桥（SVG）使用的频繁性以及生理盐水作为储存溶液的普遍使用。最近一项涉及100家表现最佳的美国医院的调查显示，在55.6%的冠状动脉旁路移植术手术中仍使用生理盐水和自体全血[26]。更重要的是，同一项调查表明，在近60%的医疗中心，血管桥的储存时间超过15分钟（甚至长达数小时），具体时长取决于心脏手术的情况。

为了进一步评估DuraGraft在美国观察性研究中显示出的潜在临床益处，一项前瞻性、双盲、随机对照试验[39]，最近已完成，该试验在同一患者中比较了经DuraGraft处理的大隐静脉移植物与经生理盐水处理的大隐静脉移植物；并采用多排螺旋CT评估移植物病变的早期解剖学标志[40]。此外，一项大型欧洲登记研究（NCT02922088）正在进行中，将用于评估长期结局（心肌梗死、死亡、再次血运重建）。

4.1. 结论

本研究结果应再次提醒外科医生，生理盐水是一种不合适的移植物保存液，无法防止缺血‐再灌注损伤。仅暴露于生理盐水中15分钟就足以导致组织存活率下降，这种损伤在60分钟内即可在显微镜下显现。尽管缓冲溶液由于其更好的生物相容性可能减轻与生理盐水相关的部分细胞毒作用，但它们不含抗氧化剂或其他可减少缺血‐再灌注损伤的成分。相比之下，DuraGraft能够防护缺血‐再灌注损伤，已证实具有良好的组织生物相容性，并且与冠状动脉旁路移植术后改善的临床结局相关，可能显著降低静脉移植物病变的发生率及后续失败风险。

资金
本文由索马鲁申资助。

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C 帕丘克是索马鲁申的首席科学官及员工。SK 拉斯顿‐史密斯和 MY 埃默特是索马鲁申的顾问。除上述披露外，作者与其他对本稿件所述主题或材料具有财务利益或财务冲突的组织或实体均无其他相关关联或财务参与。

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