静电组装提升酶活性

逐序静电组装聚合物表面活性剂冠层提高磷酸三酯酶arPTE的活性

威廉·H·张† 本杰明·M·卡特† 格雷厄姆·J·戴† 诺曼·戈万‡ 科林·杰克逊* § 亚当·W·佩里曼* †
布里斯托尔大学，细胞与分子医学学院，布里斯托尔 BS8 1TD，英国 ‡ 英国索尔兹伯里国防科学技术实验室，SP4 0JQ，英国 § 澳大利亚国立大学化学研究院，堪培拉 ACT 2601，澳大利亚

摘要

我们提出了一种生成离散分子分散酶−聚合物−表面活性剂生物偶联物的新方法。重要的是，我们证明了通过依次静电添加阳离子和阴离子聚合物表面活性剂，可使扩散限制的磷酸三酯酶arPTE的催化效率提高>3‐fold，从而实现显著的速率增强。在此过程中，聚合物表面活性剂通过离子交换在酶表面组装，形成致密冠层。所观察到的速率增强与以下机制一致：聚合物−表面活性剂冠层导致酶活性位点附近介电常数降低，从而加速了速率决定性的产物扩散步骤。这种简便的方法在提高酶效率方面具有巨大潜力，因此可能对工业酶学产生显著的积极影响。

引言

Phosphotriesterases（磷酸三酯酶，也称为有机磷酸盐水解酶）已进化为能够快速降解有机磷酸盐（有机磷化合物）。这使其成为对抗基于有机磷化合物的化学战剂和农药中毒的潜在手段，引起了广泛关注。1,2 这些高毒性化合物仍被用作冲突和秘密行动的工具，最近的实例包括在叙利亚发生的沙林攻击事件以及在英国使用的诺维乔克试剂。3 磷酸三酯酶的有效性直接取决于其降解这些化合物的速度以及酶的寿命。4 通常可以通过共价修饰（如聚乙二醇化）来提高酶的实际性能，5,6 或将酶固定化并包埋于表面。7−9 事实上，酶固定化可显著提高热稳定性，使酶能够集成到大规模高通量生产系统中，并且至关重要的是，允许这些酶多次重复使用。10−12 然而，这些方法常常带来不利影响，例如导致酶活性下降，从而可能使酶无法实际应用。10,11,13,14 此处活性的降低可能是由于表面诱导的变性、活性位点阻塞或底物/产物扩散速率降低所致。

我们之前开发了一种通过聚合物表面活性剂冠层的静电组装来修饰蛋白质表面的方法。15−18 该过程包括通过二胺对溶剂暴露的酸性残基进行亲核加成，实现化学阳离子化，生成超强阳离子蛋白，随后通过静电接枝将阴离子聚合物接枝到蛋白质表面。将表面活性剂分子连接到表面。一旦形成，这些复合物在离子上是稳定的，这通过在高盐存在下进行分析超速离心得到验证，17,19 同样，在脂质等脂肪底物存在时也不会解离酶−表面活性剂复合物。15 重要的是，所获得的杂合构建体被用于开发一系列新型生物材料，展现出多种有趣的特性，包括具有极高热稳定性的生物活性无溶剂生物流体、15,17,18 具有可回收催化活性的分级自组装膜膜、20,21 以及具有氧输送和细胞外基质形成能力的人工细胞膜结合蛋白。22,23 然而，正如其他共价蛋白质修饰方法中常报道的那样，为使蛋白质超阳离子化所需的化学阳离子化过程导致了蛋白质结构和酶活性的显著丧失。15,22,24

因此，我们描述了一种非共价方法以生成分子分散的蛋白质−聚合物表面活性剂生物偶联物（图1）。这种新方法涉及通过离子交换将基于聚乙二醇的阳离子和阴离子表面活性剂依次静电接枝到酶表面天然存在的带电残基上。由此产生的单一分散的酶−聚合物表面活性剂复合物（记作[酶][S⁺][S⁻]）与先前报道的类似所述生物偶联物，15,22 但可无需共价修饰即可轻松制备。显著的是，对于放射农杆菌磷酸三酯酶（arPTE），25 通过优化聚合物表面活性剂冠层的组成，我们观察到其催化效率提高了3倍以上。

使用[arPTE][S⁺][S⁻]进行对氧磷水解的测定，测试了不同分子量的阴离子聚合物表面活性剂，较高分子量的表面活性剂趋向于表现出更高的活性（图 S1）。此外，在仅添加阳离子表面活性剂乙氧基季铵盐后，未观察到活性增强（图 S1）。对于某些表面活性剂，若颠倒表面活性剂的添加顺序（即[S⁻][S⁺]），会导致酶聚集和沉淀，因此未进一步研究。先前的计算模型揭示了类胶束结构的形成，这限制了不同表面活性剂之间带电头基的相互作用，从而促进了冠状结构的形成，尽管存在表面活性剂−表面活性剂离子相互作用的可能性。26 催化活性的最大增强是在依次添加乙氧基季铵盐和氧化IGEPAL‐890之后实现的（图2 和 S2），与未修饰的arPTE相比，底物转换率（kcat）提高了2倍（从267±12 s⁻¹ 提高到 575±23 s⁻¹）。此外，底物结合亲和力（Km；从 56±10 提高到 36±6 μM）也得到改善，这相当于特异性常数（催化效率，kcat/Km；从 4.7×10⁶ M⁻¹s⁻¹ 提高到 1.6×10⁷ M⁻¹s⁻¹）提升了3倍以上。因此，后续所有实验均采用该方案，所得生物偶联物在此记为[arPTE][S⁺][S⁻]。

为了验证聚合物−表面活性剂与arPTE表面的结合，进行了同步辐射小角X射线散射（SR‐SAXS）实验，以评估未修饰和表面活性剂复合酶（[arPTE][S⁺][S⁻]）的尺寸。从径向平均值（rave）的对距离分布函数（P(r)，图3A）计算得出[arPTE][S⁺][S⁻]相对于arPTE，这与基于类似化学阳离子化单表面活性剂体系的计算模型相当。26 此外，arPTE与[arPTE][S⁺][S⁻]之间的Porod指数发生了轻微变化（3.8到3.5，表S1），这是由于添加了flexible表面活性剂链所致。通过SR‐SAXS分析生成的珠状模型显示，未修饰的arPTE的大小和形状与已发表的二聚体酶晶体结构（PDB ID: 2D2J）相符，而[arPTE][S⁺][S⁻]的尺寸增大，对应于在二聚体上添加了致密聚合物表面活性剂冠层（图3B 和 S3A,B）。这种尺寸增加支持通过静电驱动组装过程形成包覆性的聚合物表面活性剂层，从而产生离散且单分散的表面活性剂−酶二聚体复合物。

圆二色性（CD）测量显示arPTE和[arPTE][S⁺][S⁻]（图 S4A）的光谱完全重叠，表明表面活性剂络合并未影响其二级结构。这说明速率增强并非通过偶然稳定某种结构构象实现的，尽管不能排除CD分辨率之外的构象变化。

许多酶的观测催化效率依赖于其他外部因素贡献，例如表面诱导失活。28 当出现以下情况时，这种效应可能非常显著：在极低浓度下操作酶时，为收集高效酶（如arPTE）的线性初始速率，需要避免吸附效应。实验上，可通过添加牛血清白蛋白（BSA）以阻断非特异性蛋白质结合来防止这些吸附效应。29 因此，arPTE和[arPTE][S⁺][S⁻]均在有无添加0.1% w/v 牛血清白蛋白的情况下对对氧磷进行了测定。最初加入BSA并未导致任一系统的催化活性发生变化（测定时间<10分钟）（图 4A）。然而，在4小时期间内进行的测定中，arPTE的活性表现出逐渐下降，而[arPTE][S⁺][S⁻]、[arPTE][S⁺][S⁻]添加0.1% w/v 牛血清白蛋白或arPTE添加0.1% w/v 牛血清白蛋白则未出现此现象（图4B）。

通过同步辐射小角X射线散射（SR‐SAXS）获得的arPTE（蓝色）和[arPTE][S⁺][S⁻]（红色）的对−距离分布函数（P(r)）。表面活性剂偶联过程使酶的径向平均值（rave）从36.2埃增加到48.8埃。(b) arPTE的晶体结构（PDB ID: 2D2J，紫色）与由SR‐SAXS分析得到的arPTE（绿色）和[arPTE][S⁺][S⁻]（蓝色）的珠模型叠加。模型证实，酶在与表面活性剂冠层偶联后仍保持其寡聚状态，且表面活性剂在酶周围形成了一个一致的壳层)

为了探究天然酶活性的丧失是否由于缓慢解折叠（而非表面诱导失活）引起，进行了arPTE和[arPTE][S⁺][S⁻]的时间依赖性圆二色光谱热稳定性研究（图S4B−C）。尽管高温CD梯度显示[arPTE][S⁺][S⁻]的整体热稳定性略有提高，但在40°C下进行的等温时间进程实验表明，即使在略高于环境温度的条件下，[arPTE][S⁺][S⁻]或arPTE均未发生缓慢变性。因此，该数据支持以下情况：表面活性剂冠层或牛血清白蛋白稳定了酶，而牛血清白蛋白的存在并未增强酶的活性，而是防止了酶活性随时间的流失。此外，这种活性损失仅对长时间进行的测定时才显著，因此只能代表[arPTE]‐[S⁺][S⁻]催化效率提高的一小部分。

先前对磷酸三酯酶的研究已证实，这类高周转率酶的限速步骤是反应产物从活性位点扩散离开的过程。30 因此，致密两亲性聚合物−表面活性剂冠层的形成可能通过降低活性位点局部的介电常数，促使产物分配，从而加速扩散步骤。该机制得到了上述报道中保守的三级结构和二级结构的支持（分别通过小角X射线散射和圆二色光谱验证），以及分子量与表面活性剂和酶活性。这种情况并非前所未有，因为此前已有报道在对磷酸三酯酶进行修饰后酶活性有所提高，31 并对此进行了深入研究。PTE 纳米颗粒复合物也显示出活性增加。32,33 作者将此归因于酶周围局部微环境的变化促进了产物从活性位点的扩散。采用与 Breger 等人相同的理论模型，该模型考虑了底物和产物结合与解离速率的变化，32 我们证明，实验观察到的数据与产物释放/扩散步骤的增加一致，而非底物结合步骤（ff）（图S5）。最后，我们观察到，与对氧磷相比，蝇毒磷的速率增强幅度更大（Figure S5），蝇毒磷是一种具有更疏水性产物的底物，这进一步支持了两亲性冠层有助于疏水性产物扩散的理论。通过底物/产物分配实现酶活性增强已有报道，但仅限于酶固定化的情况；34 因此，保持酶的迁移率是一个重要的结果。然而，由于arPTE表面的改变可能会影响其活性，30,35 我们不能排除存在某种偶然的构象迁移率增强，从而导致产物释放速率增加的可能性。另一个需要考虑的因素是单体与二聚体之间寡聚平衡的变化对催化速率的影响；然而，由于我们观察到不同底物之间的速率增强存在差异，这种情况不太可能。
为了进一步探究聚合物表面活性剂络合对酶结构和功能的影响，将双表面活性剂络合方法应用于另外三种磷酸三酯酶：pdPTE‐C23、α‐酯酶7（αEst7）和DFP酶（图S7A−C）。36−38 磷酸三酯酶‐C23（pdPTE‐C23）是一种来自缺陷假单胞菌的磷酸三酯酶突变体，旨在提高对G族和V族神经毒剂的催化效率。36 αEst7是一种羧酸酯酶，已进化出可降解多种有机磷农药的能力，且在结构上不同于磷酸三酯酶超家族。37 最后，DFP酶存在于普通乌贼中，能够水解二异丙基氟磷酸（DFP），与Est7类似，在结构上也具有独特性。38 这三种酶均成功形成了具有酶活性的聚合物表面活性剂络合物，通过双表面活性剂方法。与[arPTE][S⁺][S⁻]类似，同步辐射小角X射线散射（SR‐SAXS）证实形成了具有致密冠层的离散酶−聚合物表面活性剂复合物（图S7D−F）。

有趣的是，聚合物−表面活性剂络合导致pdPTE‐C23和αEst7的kcat降低而Km升高。由于αEst7进化为水解类似于表面活性剂疏水尾部的脂肪酸酯底物，这很可能是活性位点空间位阻抑制的结果。15,24 类似地，pdPTE‐C23在活性位点处被设计了一个苯丙氨酸残基突变为谷氨酸（F132E），36 这将促进S⁺通过静电结合产生抑制作用。为了确认所观察到的抑制并非由变性引起，而是活性位点抑制所致，我们还检测了pdPTE‐C23经非离子表面活性剂处理后的活性。如预期，在高表面活性剂浓度（% w/v 测定为1%）下，pdPTE‐C23表现出与[pdPTE‐C23][S⁻]相当的抑制作用（图S8）。然而，透析后，经非离子表面活性剂处理的pdPTE‐C23活性得以恢复，而[pdPTE‐C23][S⁻]则未恢复。这表明速率降低是由于表面活性剂对活性位点的抑制，并且也验证了即使在稀释浓度下，表面活性剂冠层复合物仍能保持稳定。

最后，对于DFP酶，我们未观察到未修饰酶与生物偶联物[DFPase][S⁺][S⁻]之间在亲和力或反应速率上的变化。由于DFP酶的速率限制步骤是在催化循环中氟从磷上解离，38 此处观察到无速率增强（或降低）的现象支持了我们提出的提高产物解离速率的机制。

arPTE和[arPTE][S⁺][S⁻]在室温下有无0.1% w/v 牛血清白蛋白时的归一化催化速率（kcat），显示BSA本身似乎不直接影响催化速率。(b) 4 nM 酶储备液在室温下随时间变化的活性，表明疏水性变性会显著影响arPTE（蓝色）在较长时间内的观测速率。加入牛血清白蛋白的arPTE（红色）、[arPTE][S⁺][S⁻]（绿色）以及[arPTE][S⁺][S⁻]与牛血清白蛋白（紫色）均未表现出这种活性损失。所有测定均按支持信息中所述，在pH 8.0、含30 mM HEPES和100 μM氯化钴的缓冲液中进行)

结论

总之，我们已经证明，我们的静电双表面活性剂偶联方法可以轻松应用于生成具有活性的酶−聚合物表面活性剂复合物的水相分子分散，而无需进行共价修饰。此外，我们表明该方法可被调控以使arPTE的催化效率提高3倍以上，并通过疏水分区加速产物扩散速率来解释这一改进。我们还表明，表面结合的聚合物表面活性剂冠层可保护arPTE免受表面诱导失活的影响。尽管我们可以轻易将该方法应用于其他磷酸三酯酶以获得具有催化活性的复合物，但显然速率增强依赖于催化机制、表面电荷、疏水性以及活性位点几何结构等参数。原则上，使用两亲性冠层可与其他有益的酶修饰（如固定化）相兼容。将表面活性剂或酶通过共价连接至表面可能赋予酶更高的选择性34等特性，并可使酶性能优于单纯固定化所能达到的效果，但代价是酶迁移率的降低。通过正确选择聚合物−表面活性剂并结合理性酶设计，应有可能在水相和非水相条件下提升工业相关酶的性能。39,40