32、大肠杆菌基因组分析详细指南

大肠杆菌基因组分析详细指南

1. 前期准备与安装检查

在开始基因组分析之前，我们需要进行一些必要的准备工作。首先，使用详细列表命令 ls -l 可以将当前文件夹中的所有文件打印到屏幕上。其中，文件属性带有 “x” 的即为可执行文件，也就是程序。

在解压二进制文件后，为了节省大约 430MB 的磁盘空间，我们可以使用 rm 命令删除源文件 ncbi-blast-2.2.25+-ia32-linux.tar 。接下来，我们要检查 BLAST+ 的安装是否成功。

运行以下命令来查看 blastp 程序的帮助信息：

$ ./bin/blastp -h

执行该命令后，如果出现许多行输出，说明程序可以正常运行。

2. 蛋白质组下载

我们将从美国国家生物技术信息中心（NCBI）的 FTP 服务器下载两种大肠杆菌的蛋白质组。具体步骤如下：
1. 下载大肠杆菌 K12 的蛋白质组 ：
bash $ wget "ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/Escherichia_coli_K_12_substr_MG1655_uid57779/NC_000913.faa"
2. 下载大肠杆菌 O157:H7 的蛋白质组 ：
bash $ wget "ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Bacteria/Escherichia_coli_O157_H7_EDL933_uid57831/NC_002655.faa"
3. 重命名文件 ：为了方便后续操作，我们将下载的文件重命名为 ecoli-k12.faa 和 ecoli-h7.faa 。
bash $ mv NC_000913.faa ecoli-k12.faa $ mv NC_002655.faa ecoli-h7.faa
4. 下载大肠杆菌 O104:H4 的蛋白质组 ：从美国病原体系统资源整合中心（PATRIC）的 FTP 服务器下载该菌株的蛋白质组，并将其重命名为 ecoli-h4.faa 。
bash $ wget "http://brcdownloads.vbi.vt.edu/patric2/genomes/Escherichia_coli_TY-2482/Escherichia_coli_TY-2482.PATRIC.faa" $ mv Escherichia_coli_TY-2482.PATRIC.faa ecoli-h4.faa

3. 统计各文件中的蛋白质数量

由于这些文件是以 FASTA 格式保存的，我们可以通过搜索每个文件中 “>” 字符的数量来统计蛋白质的数量。

$ grep -c ">" ecoli*faa

运行结果如下：
| 文件名称 | 蛋白质数量 |
| ---- | ---- |
| ecoli-h4.faa | 5414 |
| ecoli-h7.faa | 5298 |
| ecoli-k12.faa | 4146 |

从结果可以看出，大肠杆菌 O157:H7 比大肠杆菌 K12 大约多 1000 个蛋白质，而大肠杆菌 O104:H4 的蛋白质编码序列更多。

4. 基因组比较

我们将使用 BLAST+ 来对大肠杆菌 O157:H7 和大肠杆菌 K12 的翻译注释基因组进行计算比较，这需要两个基本步骤：为一个基因组设置数据库文件和进行查询。

4.1 BLAST 数据库设置

我们为大肠杆菌 K12 创建数据库，使用 makeblastdb 命令，具体操作如下：

$ ls
ecoli-h4.faa ecoli-h7.faa ecoli-k12.faa ncbi-blast-2.2.25+
$ ./ncbi-blast-2.2.25+/bin/makeblastdb -in ecoli-k12.faa -dbtype prot -title "Escherichia coli K12" -out ecolik12 -parse_seqids

该命令的参数说明如下：
- -in ecoli-k12.faa ：指定用于构建数据库的 FASTA 格式输入文件。
- -dbtype prot ：告诉 makeblastdb 我们的序列是蛋白质序列，而不是核苷酸序列。
- -title ：设置 BLAST 结果文件的标题。
- -out ecolik12 ：命名数据库及其相关文件。
- -parse_seqids ：生成一个额外的数据库，以便通过基因标识符从 BLAST 数据库中检索单个序列。

成功执行该命令后，活动文件夹中会出现八个新文件，这些是 BLAST+ 可读的数据库文件。我们只需记住数据库名称 ecolik12 即可。

4.2 BLAST 查询

接下来进行最关键的查询步骤，该步骤可能需要约 30 分钟。我们使用 blastp 程序来测试大肠杆菌 O157:H7 中的每个蛋白质是否能在大肠杆菌 K12 的基因组中找到。

$ time ./ncbi-blast-2.2.25+/bin/blastp -db ecolik12 -query ecoli-h7.faa -out h7vsk12.txt -evalue .00001

该命令的参数说明如下：
- -db ecolik12 ：指定要查询的数据库名称。
- -query ecoli-h7.faa ：指定包含要查询的蛋白质序列的 FASTA 格式输入文件。
- -out h7vsk12.txt ：定义用于保存查询结果的输出文件。
- -evalue .00001 ：限制每个蛋白质要显示的命中数量，该值对应于期望阈值或期望值，值越小，匹配越显著。

查询结果将保存在 h7vsk12.txt 文件中，该文件较大，有 707447 行，约 31MB。

5. 查看 BLAST+ 结果文件

我们可以使用 less 命令打开结果文件 h7vsk12.txt 查看其内容：

less h7vsk12.txt

使用箭头键和 PageUp/Down 键滚动文本，按 Q 键退出。结果文件的结构如下：
- 开头是 BLAST 程序的版本和引用信息。
- 接着是被查询的数据库信息。
- 每个查询序列以 Query= 开头。
- 有些序列可能没有命中结果，而有些序列可能有多个命中结果，每个命中结果会显示序列比对信息。

为了找出大肠杆菌 O157:H7 特有的蛋白质，我们需要关注那些在大肠杆菌 K12 中没有命中结果的序列。

6. 处理 BLAST+ 结果文件

由于结果文件太大，手动浏览几乎不可能。我们可以使用 AWK 编程语言来提取我们需要的信息。

6.1 提取包含 Query= 或 No hits 的行

$ awk '/Query=/ || /No hits/{print}' h7vsk12.txt | head

6.2 提取紧跟在 No hits found 后面的 Query= 行

$ awk '/Query=/ || /No hits/{print}' h7vsk12.txt | awk '{i++; line[i]=$0; if($0~/No hits/){print line[i-1]}}' | head

通过这一步，我们得到了大肠杆菌 O157:H7 特有的蛋白质列表，共有 1099 个。

6.3 清理列表

列表中包含许多假定、假设或未知的蛋白质，我们可以使用 egrep 命令排除包含这些关键词的行：

$ awk '/Query=/ || /No hits/{print}' h7vsk12.txt | awk '{i++; line[i]=$0; if($0~/No hits/){print line[i-1]}}' | egrep -v "([Uu]nknown|[Pp]utative|[Hh]ypothetical)" | head -20

通过以上步骤，我们得到了大肠杆菌 O157:H7 特有的、有注释的蛋白质列表。这些蛋白质可能与大肠杆菌 O157:H7 的致病性有关，我们可以进一步研究这些蛋白质，以了解大肠杆菌 O157:H7 的致病机制。

以下是整个操作流程的 mermaid 流程图：

graph LR
    A[安装检查] --> B[蛋白质组下载]
    B --> C[统计蛋白质数量]
    C --> D[基因组比较]
    D --> D1[数据库设置]
    D --> D2[查询]
    D2 --> E[查看结果文件]
    E --> F[处理结果文件]
    F --> F1[提取特定行]
    F --> F2[提取紧跟行]
    F --> F3[清理列表]

通过以上详细的操作步骤，我们可以完成大肠杆菌基因组的比较分析，找出可能与致病性相关的蛋白质。在实际应用中，我们可以根据这些结果进行更深入的研究，例如对这些蛋白质进行功能验证，以揭示大肠杆菌的致病机制。

大肠杆菌基因组分析详细指南

7. 对特有的有注释蛋白质的进一步分析

得到大肠杆菌 O157:H7 特有的、有注释的蛋白质列表后，我们可以对这些蛋白质进行进一步的分类和功能推测。以下是对部分蛋白质功能的简单分析：
| 蛋白质编号 | 蛋白质名称 | 可能功能 |
| ---- | ---- | ---- |
| gi|15799681|thr 操纵子前导肽 | 参与苏氨酸操纵子的调控 |
| gi|15799732|gyrase 抑制的抗毒素 | 可能与抑制 gyrase 相关，影响细菌的 DNA 拓扑结构 |
| gi|15799733|gyrase 抑制的毒素 | 与抗毒素相对应，可能起到毒性作用 |
| gi|15799819|菌毛蛋白 | 参与细菌的黏附等过程 |
| gi|15800218|RTX 家族外蛋白 | 可能具有细胞毒性等作用 |

通过这样的分类和分析，我们可以初步了解这些特有的蛋白质在大肠杆菌 O157:H7 中的可能作用，为后续的实验研究提供方向。

8. 结果验证与拓展

为了确保我们得到的结果的准确性和可靠性，我们可以进行一些验证工作。

8.1 重复实验

使用相同的方法和参数，再次对大肠杆菌 O157:H7 和大肠杆菌 K12 进行基因组比较分析，看是否能得到相似的结果。如果两次结果差异较大，需要检查实验过程中是否存在错误或不稳定因素。

# 再次设置数据库
$ ./ncbi-blast-2.2.25+/bin/makeblastdb -in ecoli-k12.faa -dbtype prot -title "Escherichia coli K12" -out ecolik12 -parse_seqids
# 再次进行查询
$ time ./ncbi-blast-2.2.25+/bin/blastp -db ecolik12 -query ecoli-h7.faa -out h7vsk12_again.txt -evalue .00001

8.2 与其他工具比较

可以使用其他的序列比对工具，如 FASTA 等，对相同的基因组进行比较，看是否能得到类似的特有的蛋白质列表。如果不同工具得到的结果有较大差异，需要进一步分析原因。

# 使用 FASTA 进行比对示例（假设已安装 FASTA）
$ fasta36 -d ecolik12 -i ecoli-h7.faa -o h7vsk12_fasta.txt

8.3 拓展分析

除了比较大肠杆菌 O157:H7 和大肠杆菌 K12，我们还可以将更多的大肠杆菌菌株纳入分析范围，如大肠杆菌 O104:H4 等。这样可以更全面地了解不同菌株之间的差异和相似性，找出更广泛的与致病性相关的蛋白质。

# 为大肠杆菌 O104:H4 创建数据库
$ ./ncbi-blast-2.2.25+/bin/makeblastdb -in ecoli-h4.faa -dbtype prot -title "Escherichia coli O104:H4" -out ecolih4 -parse_seqids
# 将大肠杆菌 O157:H7 与大肠杆菌 O104:H4 进行比较
$ time ./ncbi-blast-2.2.25+/bin/blastp -db ecolih4 -query ecoli-h7.faa -out h7vsh4.txt -evalue .00001

9. 总结与展望

通过以上一系列的操作，我们完成了对大肠杆菌 O157:H7 和大肠杆菌 K12 的基因组比较分析，找出了大肠杆菌 O157:H7 特有的、有注释的蛋白质列表。这些蛋白质可能与大肠杆菌 O157:H7 的致病性密切相关。

在未来的研究中，我们可以基于这些结果进行更深入的实验研究。例如，对这些特有的蛋白质进行基因敲除实验，观察细菌的致病性是否发生变化；或者对这些蛋白质进行结构分析，了解其作用机制。同时，随着测序技术的不断发展，我们可以获取更多的大肠杆菌菌株的基因组数据，进行更全面和深入的分析，为预防和治疗大肠杆菌感染提供更有效的策略。

以下是结果验证与拓展部分的 mermaid 流程图：

graph LR
    A[重复实验] --> B[与其他工具比较]
    B --> C[拓展分析]
    D[特有的有注释蛋白质列表] --> A
    D --> B
    D --> C

总之，通过基因组比较分析，我们为研究大肠杆菌的致病性提供了重要的线索和基础，未来的研究有望进一步揭示大肠杆菌的致病奥秘。