单细胞文库构建秘籍，90%的人不知道这些细节！

本文将介绍单细胞测序的一个重要环节 —— 文库构建。文库构建主要包含三个步骤：DNA 片段化、末端修复与加 A 尾，接头连接，以及 Index PCR（即 PCR 富集）。

1、DNA 片段化、末端修复及加 A 尾（Fragment DNA、End Repair、dA-tailing）

2、接头连接（Ligation Adaptor）

3、目的片段的 PCR 富集（Sample Index PCR）

4、文库质量控制（浓度检测与片段大小检测）

         

1、DNA 片段化 / 末端修复 / 添加 A 尾

DNA 片段化
DNA 片段化主要借助物理手段（如超声、热解）或酶切技术，将大片段 DNA 随机断裂为小片段。其中，酶切法虽存在一定序列偏好性，但其断裂的 DNA 片段长度多在 1kb 以内（如 200bp、350bp、500bp 等），且操作简便、耗时较短。

 

末端修复
经片段化处理的 DNA 链存在缺口，两端多为粘性末端。需通过末端修复反应，切除 DNA 的 3' 突出端并填补 5' 凹陷端，使其转化为含 5'- 磷酸基团与 3'- 羟基的平末端 DNA。

 

添加 A 尾
继而在 DNA 的 3' 末端添加 dA，使其转变为粘性末端，以便后续与接头互补配对；同时对 DNA 的 5' 末端进行磷酸化修饰。

2、接头连接

  
接下来对修复后的 DNA 片段进行接头连接，该过程主要利用 DNA 连接酶，将 3' 端带有 dA 的 DNA 片段与 adapter 接头相连接。接头的分类方式主要有以下两种：

 

单端 Index 与双端 Index
依据 Index 的位置差异，可将接头连接方式分为单端 Index 与双端 Index。单端 Index 是指构建完成的文库序列中，仅在 P5 端或 P7 端存在 Index 结构；双端 Index 则是指在 P5 端和 P7 端均存在 Index 结构。

 

长接头与短接头
按照接头是否符合 PCR free 建库的要求，可将接头分为长接头（完整 Y 型接头）和短接头（非完整 Y 型接头）。长接头包含 P5/P7 序列、Index 序列以及 Read1/Read2 序列，通过 TA 克隆连接到 DNA 片段后可形成完整的文库结构，若文库产量充足，无需进行 PCR 扩增即可直接上机测序。短接头仅包含 Read1/Read2 序列，通过 TA 克隆连接到 DNA 片段后，需经 PCR 扩增引入 P5/P7 和 Index 序列，形成完整的文库结构后才能上机测序。

   

3、PCR 富集（Sample Index PCR）

  

对完成接头连接的 DNA 片段进行 PCR 扩增，扩增产物中包含大量原始模板正反链的插入片段（Insert Fragment）。随后采用磁珠对 PCR 产物进行纯化，纯化后符合质量标准的产物可用于高通量测序实验。

4、文库质控

  
经纯化的 PCR 产物需进一步检测浓度与片段大小。其中，浓度达到上机测序的阈值即可；片段大小需满足特定要求：片段范围为 300-700bp，主峰集中在 450-550bp，且无接头片段及大片段污染。通过质控的产物可用于高通量测序分析。

 

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