Day7-测序知识

一.测序知识

1.三种测序技术对比

2.测序专有名词

①基因组学（核酸序列分析）

②转录组学（基因表达分析）：

（1）mRNA-Seq
（2）IncRNA-Seq（长链非编码RNA）
（3）sRNA-Seq（主要是miRNA-Seq）

③蛋白质组学

④代谢组学

二.测序技术原理及常用数据格式简介

1.第一代测序技术:

1977年Sanger等发明双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法。

Sanger测序原理

由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，得到片段大小不一致的DNA混合物，然后通过凝胶电泳分离和放射自显影后识别确定待测分子的DNA序列。

特点：准确性高，读长长，通量低

2.第二代测序技术

第二代测序技术（Next-generation sequencing）应运而生。

代表有Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和Life technologies（ABI）公司的SOLiD技术；Life technologies公司的Ion Torrent和Ion Proton技术等，经过不断的竞争，454、SOLiD 和Helicos平台不再开发新的仪器，Illumina平台最终成为市场主流，其方法为边合成边测序。

Illumina平台：边合成边测序

操作流程：

1.DNA文库构建

2.簇的生成——桥式PCR

3.测序

4.数据生成

特点：通量高、时间短、读长短。

3.第三代测序技术

即单分子实时DNA测序。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序，凭借超长的读长和可直接检测表观修饰等特点使其成为市场的新宠。目前以Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为主流。

三.常用数据格式

1.DNA序列表征

A =腺嘌呤           

C =胞嘧啶            

G =鸟嘌呤             

T =胸腺嘧啶           

U =尿嘧啶

R = GA（嘌呤）        

Y = TC（嘧啶）    

K = GT（酮）    

M = AC（氨基）

S = GC

W = AT

B = GTC

D = GAT

H = ACT

V = GCA

N = AGCT（任何）

2.Fastq & Fasta

Fastq格式：一种基于文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其测序质量信息的标准格式,一般都包含有4行。

第一行：由‘@’开始，后面跟着序列ID和可选的描述，序列ID是唯一的；

第二行：碱基序列；

第三行：由‘+’开始，后面是序列的描述信息；

第四行：第二行序列的质量评价(quality value)。

例如:

Fasta格式：

1：以“>”为开头，fasta格式标志。

2：序列ID号，gi号，NCBI数据库的标识符，具有唯一性。

格式为：gi|gi号|来源标志|序列标志（接收号、名称等），若某项缺失可以留空，“|”保留。

3：序列描述。

4：碱基序列，序列中允许空格、换行、空行，一般一行60个。

如何将Fastq文件→Fasta文件？

Linux命令

法1：sed '/^@/!d;s//>/;N' your.fastq > your.fasta

法2：seqtk seq -A input.fastq  > output.fasta

推荐处理软件：

FASTX-Toolkit

GenBank & EMBL