批量差异分析以及箱线图的绘制_批量箱线图-优快云博客

本文链接：https://blog.youkuaiyun.com/II_IO/article/details/147795377

本文的重点在于箱线图的调整，对ggplot2函数各个参数进行比较详细的剖析，方便绘图。

1 准备文件

准备文件包括表达矩阵，分组信息，表达矩阵行名为基因名，列名为样本名。

2 运行代码

2.1 加载R包、设定输入输出

# 加载必要的包
library(limma)
library(ggplot2)
library(ggpubr)
library(dplyr)
library(tidyr)

# 指定输出位置
output_folder <- "D:/Bio_Project/DEseq_batch/output"    # 这里以我电脑中的工作路径为例
if (!dir.exists(output_folder)) {
  dir.create(output_folder)
}
output_file <- file.path(output_folder,"boxplot.tiff")

# 输入
setwd("D:\\Bio_Project\\DEseq_batch\\input_GEO")
genelist <- "genelist.txt"
exp <- "GEO.txt"
group <- "group.txt"

2.2 读取基因

# 读取基因列表
gene_list <- read.table(genelist, header = TRUE, stringsAsFactors = FALSE)[,1]

# 读取表达矩阵
exp_data <- read.table(exp, header = TRUE, row.names = 1, stringsAsFactors = FALSE, check.names = FALSE)

# 读取分组信息
group_info <- read.table(group, header = TRUE, stringsAsFactors = FALSE)
colnames(group_info) <- c("sample", "group")

# 2. 数据预处理
# 过滤表达矩阵，只保留基因列表中的基因
exp_filtered <- exp_data[rownames(exp_data) %in% gene_list, ]

# 转置表达矩阵以便与分组信息合并
exp_t <- as.data.frame(t(exp_filtered))
exp_t$sample <- rownames(exp_t)

# 合并表达数据和分组信息
merged_data <- merge(exp_t, group_info, by = "sample")

2.3 差异分析

# 准备结果数据框
diff_results <- data.frame(gene = character(),
                           p.value = numeric(),
                           stringsAsFactors = FALSE)

# 对每个基因进行t检验
for(gene in gene_list) {
  if(gene %in% colnames(merged_data)) {
    # 提取当前基因的表达数据
    normal_data <- merged_data[merged_data$group == "Normal", gene]
    tumor_data <- merged_data[merged_data$group == "Tumor", gene]
    
    # 进行t检验
    test_result <- t.test(normal_data, tumor_data)
    
    # 存储结果
    diff_results <- rbind(diff_results, 
                          data.frame(gene = gene, 
                                     p.value = test_result$p.value))
  }
}

# 添加显著性标记
diff_results <- diff_results %>%
  mutate(significance = case_when(
    p.value < 0.001 ~ "***",
    p.value < 0.01 ~ "**",
    p.value < 0.05 ~ "*",
    p.value < 0.1 ~ ".",
    TRUE ~ "ns"
  ))

# 筛选显著差异基因 (p.value < 0.05)
sig_genes <- diff_results[diff_results$p.value < 0.05, "gene"]

2.4 绘图

绘图部分代码我会拆解的的比较细致（帮助大家绘出好看标准的图），如果大家觉得我的绘图风格还可以的话可以直接抄我的代码（图太大上传不了代码，大家运行后就可以得到tiff）。

接下来是代码的拆解：

plot_data <- merged_data %>%
    select(sample, group, all_of(sig_genes)) %>%
    pivot_longer(cols = -c(sample, group), 
                 names_to = "gene", 
                 values_to = "expression") %>%
    left_join(diff_results %>% select(gene, significance), by = "gene")

这段代码运行的是输入数据的准备，%>% 是管道操作符，它可以将前一个函数的输出作为后一个函数的输入，比如在这个例子中如果没有merged_data %>%，就需要一个中间函数，写成

# 1. 选择指定列
selected_data <- select(merged_data, sample, group, all_of(sig_genes))

# 2. 将数据从宽格式转换为长格式
long_data <- pivot_longer(
  data = selected_data,
  cols = -c(sample, group),
  names_to = "gene",
  values_to = "expression"
)

# 3. 筛选差异结果中的基因和显著性列
significance_data <- select(diff_results, gene, significance)

# 4. 左连接数据框
plot_data <- left_join(
  x = long_data,
  y = significance_data,
  by = "gene"
)

随后这个函数最后的画图部分，首先是精简部分，不含多余的注释：

# 计算全局最大表达值用于统一标记位置
  global_y_max <- max(plot_data$expression)
  
  p <- ggplot(plot_data, aes(x = gene, y = expression, color = group)) +
    geom_boxplot(outlier.shape = NA, fill = NA, width = 0.6) +
    geom_jitter(position = position_jitterdodge(jitter.width = 0.2, dodge.width = 0.6), 
                alpha = 0.6, size = 0.75) +
    # 统一标记位置（所有标记在同一水平）
    geom_text(data = diff_results %>% filter(gene %in% sig_genes),
              aes(x = gene, y = global_y_max * 1.05, label = significance),
              inherit.aes = FALSE, size = 5, vjust = 0.5) +
    scale_color_manual(values = c("Normal" = "#2076b2", "Tumor" = "#af280a")) +
    labs(x = "Genes", y = "Expression Value", color = "Group") +
    # 调整Y轴范围以容纳标记
    scale_y_continuous(limits = c(NA, global_y_max * 1.05)) +
    theme_minimal() +
    theme(
      axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1, size = 12),
      axis.text.y = element_text(size = 12),
      axis.title = element_text(size = 20),
      legend.text = element_text(size = 20),
      legend.title = element_text(size = 20),
      panel.grid.major = element_blank(),
      panel.grid.minor = element_blank(),
      panel.border = element_rect(fill = NA, color = "black"),
      # 关键修改：将图例放在右侧中间位置
      legend.position = "right",
      legend.justification = "center",
      # 增加右边距给图例留空间
      # plot.margin = margin(1, 3, 1, 1, "cm"),
      # 调整图例框样式
      legend.box.background = element_rect(color = NA, fill = "white", size = 0.5),
      legend.box.margin = margin(0, 0, 0, 10)
    ) +
    # 确保图例在绘图区域外也有足够空间
    guides(color = guide_legend(
      title.position = "top",
      title.hjust = 0.5,
      label.position = "right",
      keywidth = unit(0.5, "cm"),
      override.aes = list(size = 2))  # 调图例中图标大小
    )
  
  print(p)

随后是注释部分，注释了在ggplot中每个函数及其参数的作用：

# 创建ggplot对象，设置全局映射：x轴为基因，y轴为表达值，颜色映射到组别
p <- ggplot(plot_data, aes(x = gene, y = expression, color = group)) +
  
  # 添加箱线图层：不显示离群点，不填充内部，宽度设为0.6
  geom_boxplot(outlier.shape = NA, fill = NA, width = 0.6) +
  
  # 添加抖动散点图层：在水平方向上抖动0.2单位以避免重叠，按组别躲避0.6单位
  # 散点设置为半透明(alpha=0.6)和小尺寸(size=0.75)
  geom_jitter(position = position_jitterdodge(jitter.width = 0.2, dodge.width = 0.6), 
              alpha = 0.6, size = 0.75) +
  
  # 添加显著性标记文本：在所有基因上方相同高度(global_y_max*1.05)处添加星号标记
  # 使用单独的数据源(diff_results)，不继承全局映射，字体大小为5，垂直居中对齐
  geom_text(data = diff_results %>% filter(gene %in% sig_genes),
            aes(x = gene, y = global_y_max * 1.05, label = significance),
            inherit.aes = FALSE, size = 5, vjust = 0.5) +
  
  # 手动设置颜色映射：正常组为蓝色(#2076b2)，肿瘤组为红色(#af280a)
  scale_color_manual(values = c("Normal" = "#2076b2", "Tumor" = "#af280a")) +
  
  # 设置坐标轴和图例标题
  labs(x = "Genes", y = "Expression Value", color = "Group") +
  
  # 设置Y轴范围：上限扩展到全局最大值的1.05倍，以容纳显著性标记
  scale_y_continuous(limits = c(NA, global_y_max * 1.05)) +
  
  # 使用简约主题
  theme_minimal() +
  
  # 自定义主题元素
  theme(
    # x轴标签旋转45度并右对齐，字体大小12
    axis.text.x = element_text(angle = 45, hjust = 1, size = 12),
    # y轴标签字体大小12
    axis.text.y = element_text(size = 12),
    # 坐标轴标题字体大小20
    axis.title = element_text(size = 20),
    # 图例文本和标题字体大小20
    legend.text = element_text(size = 20),
    legend.title = element_text(size = 20),
    # 隐藏网格线
    panel.grid.major = element_blank(),
    panel.grid.minor = element_blank(),
    # 添加黑色边框
    panel.border = element_rect(fill = NA, color = "black"),
    # 将图例放在右侧并垂直居中
    legend.position = "right",
    legend.justification = "center",
    # 设置图例背景和边距
    legend.box.background = element_rect(color = NA, fill = "white", size = 0.5),
    legend.box.margin = margin(0, 0, 0, 10)
  ) +
  
  # 自定义图例样式
  guides(color = guide_legend(
    title.position = "top",      # 图例标题在顶部
    title.hjust = 0.5,           # 图例标题水平居中
    label.position = "right",    # 图例标签在右侧
    keywidth = unit(0.5, "cm"),  # 图例符号宽度
    # 调整图例中符号的大小为2
    override.aes = list(size = 2)
  ))

ggplot中起主要作用函数：