超高灵敏度与精准定位：PLA技术解锁蛋白修饰新维度

蛋白翻译后修饰（PTM）是指在核糖体合成蛋白质多肽链之后，对其氨基酸侧链或末端进行的各种化学修饰。这些修饰不改变蛋白质的基因编码序列，但极大地扩展了蛋白质的结构和功能多样性。PTM精细而动态地调控着几乎所有的细胞过程，包括：激活或抑制酶的活性，改变蛋白质的定位、稳定性和相互作用,介导细胞对环境信号（如应激、激素）的反应,决定蛋白质的命运（合成或降解）。简言之，PTM是赋予蛋白质最终功能特性、调控复杂生命活动不可或缺的精密机制。

邻近连接技术（Proximity Ligation Assay,PLA）通过特异性一抗靶向目的蛋白，结合互补寡核苷酸标记的二抗(PLA探针)，经抗原-抗体结合形成邻近探针复合物，最终通过滚环扩增和荧光探针标记后实现蛋白互作的原位可视化检测。PLA在蛋白翻译后修饰（PTM）检测中相比传统的免疫共沉淀（Co-IP）具有显著优势，主要体现在灵敏度、空间分辨率、定量分析等方面。

图1 PLA技术原理（Krieger et al., 2022）。

01 PLA检测蛋白修饰的实验原理

使用两种一抗：抗靶蛋白抗体（如Anti-EGFR）识别目标蛋白，蛋白修饰的抗体（如抗泛素抗体Anti-Ubiquitin）识别结合的修饰位点或形成的链状修饰。当蛋白发生修饰时，两种抗体在空间上接近，PLA二抗（带DNA标记）会介导连接反应，生成可检测的荧光或显色信号。

02 实验流程

(1)样本准备

细胞或组织固定：用4%多聚甲醛固定，透化（如0.1% Triton X-100）。

(2)抗体孵育

①一抗孵育：抗靶蛋白抗体（如Rabbit Anti-EGFR）+蛋白修饰的抗体如：抗泛素抗体（如Mouse Anti-Ubiquitin）；

注意：需选择不同种属来源的一抗（如兔源+鼠源），以匹配后续PLA二抗。

②PLA二抗孵育：使用种属特异性的PLA探针（如PLA Probe Anti-Rabbit PLUS/Anti-Mouse MINUS）。

(3)连接与扩增

①连接反应：DNA连接酶将邻近的PLA探针连接成环状DNA模板；

②荧光信号扩增：通过滚环扩增（RCA）生成荧光标记的DNA点（可用荧光显微镜观察）。

(4)信号检测

①成像：共聚焦显微镜计数荧光点（每个点代表一个泛素化事件）；

②定量：用ImageJ等软件分析荧光点数量/细胞。

03 应用案例

(1)PLA检测蛋白磷酸化

Chen等人运用PLA技术验证EGFR蛋白可以被EGF诱导后出现磷酸化。利用邻近连接（PLA）检测EGF刺激后的pEGFR-Tyr1068水平，将A431细胞血清饥饿16小时后，用不含血清的培养基加入EGF（10ng/ml）处理10分钟，结果显示EGF刺激后可以促进EGFR蛋白的Tyr1068位点磷酸化水平。

A图展示了PLA能够高灵敏地检出EGF刺激后pEGFR-Tyr1068的磷酸化。

B图展示了这两种信号的定量结果。

图2 PLA检测A431细胞中EGFR蛋白磷酸化（Chen 2013., 2013）。

(2)PLA检测蛋白泛素化

Hegazy等人运用PLA检测EGFR蛋白的泛素化水平，结果展示如下：

①第一行左图为实验组（anti-EGFR兔源和anti-Ubiquitin鼠源），红色点即为PLA信号，表明EGFR蛋白的泛素化，其中siCTL表示为siRNA阴性对照；

②第一行右图也为实验组（anti-EGFR兔源和anti-Ubiquitin鼠源），但进行了COPS3敲低，COPS3是COPS9信号复合体的组成部分，参与去泛素化过程。敲低COPS3会减少EGFR的泛素化，从而导致EGFR-Ubiquitin PLA信号（红色亮点）减少（即泛素化减少）；

③第二行左图（anti-Ubiquitin鼠源和anti-IgG兔源）和右图（anti-EGFR兔源和anti-IgG鼠源）都是阴性对照，未出现PLA信号。

图3 PLA检测EGFR蛋白的泛素化（Hegazy et al., 2020）。

(3)PLA检测蛋白乙酰化

Karaca等人检测CtBP2乙酰化，分别在常氧（对照）、缺氧、2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）处理的神经干细胞（NSCs）。在低氧处理或2-脱氧-D-葡萄糖（2DG）处理后，通过PLA检测发现，神经干细胞（NSCs）中核内CtBP2的总乙酰化水平显著升高，平均每细胞的PLA信号数从对照组的16.96分别增至25.83（低氧）和24.89（2DG）。

图4 PLA检测CtBP2蛋白的乙酰化（Karaca et al., 2015）。

04 科普小结：PLA的技术优势

①超高灵敏度：滚环扩增实现信号放大1000倍，可解析<40nm范围内的蛋白弱互作；

②原位空间定位：保留细胞/组织微环境，一张图看清互作发生位置；

③高特异性：双抗体+双DNA探针；

④兼容多靶标：可同时检测多对互作（不同荧光通道），兼容IF/FISH等其他标记技术；

⑤样本友好：石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片均适用。

参考文献

Chen T C, Liu Y W, Huang YH, et al. Protein phosphorylation profiling using an in situ proximity ligation assay:phosphorylation of AURKA-elicited EGFR-Thr654 and EGFR- Ser1046 in lung cancer cells[J]. PloS one, 2013,8(3): e55657.

Hegazy M, Cohen-Barak E, Koetsier JL,et al.Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ[J]. Current protocols in cell biology, 2020,89(1): e115.

Karaca E, Lewicki J,Hermanson 0. Oxygen-dependent acetylation and dimerization of the corepressor CtBP2 in neural stem cells[J]. Experimental Cell Research,2015,332(1):128-135.

Krieger C C, Boutin A, Neumann S, et al. Proximity ligation assay to study TSH receptor homodimerization and crosstalk with IGF-1 receptors in human thyroid cells[J]. Frontiers in endocrinology, 2022, 13: 989626.