Nature Genetics | 肿瘤免疫如何做出一些差异化？单细胞空转+三级淋巴样结构+低氧微环境，思路其实还是筛选细胞！_multi-omic profiling highlights factors associated-优快云博客

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免疫治疗、肿瘤微环境是癌症生信研究的热门。当然，越热门往往就越卷，大家研究思路都是单细胞+bulk+空转，那么怎么样才能做出一些差异化的亮点。今天便给各位老铁们分享一篇于2024年12月10号发表在 Nature Genetics [31.7] 的单细胞空转多组学文章："Multi-omic profiling highlights factors associated with resistance to immuno-chemotherapy in non-small-cell lung cancer"，多组学分析突出了与非小细胞肺癌免疫化疗耐药相关的因素。

DOI:10.1038/s41588-024-01998-y

这篇文章除了结合空间转录组鉴定了一些关键细胞群以外，还围绕三级淋巴样结构乃至低氧微环境展开了一些论述。三级淋巴样结构 (TLSs) 对于 T 细胞初级激活、B 细胞激活以及 T 细胞和 B 细胞分化至关重要。TLSs 与大多数实体瘤预后呈正相关,并且可以预测对免疫检查点阻断疗法的反应。TLS（三级淋巴结构）在NSCLC的肿瘤微环境中具有多种成熟阶段，包括：①早期淋巴样聚集（表达高水平的LTi标志物、低水平细胞因子）；②激活的TLS（细胞因子表达高）；③ 衰退/晚期 TLS（细胞因子表达减少或者极低）。

目前，大多数单细胞 RNA 测序研究尚未阐明 TLSs 的几何结构或其在肿瘤微环境中形成、成熟和功能的机制，这是由于缺乏 B 细胞和 T 细胞的空间组织信息所致。如果说你也有空间转录组的数据，不妨借鉴一下这篇文章的思路，围绕 TLSs 展开。

| 摘要

背景：尽管ICB疗法已经成为非小细胞肺癌的治疗新范式，但仍有许多患者对这种疗法产生耐药。

研究方法与结论：作者通过分析19位患者的肿瘤微环境（TME），研究肿瘤细胞状态和空间细胞组成，探索免疫化疗耐药性相关因素。他们发现，肿瘤细胞与分泌磷蛋白1（SPP1）阳性巨噬细胞和癌症相关成纤维细胞（CAF）相互作用，导致胶原纤维的沉积，这种现象抑制了T细胞的渗透，从而影响治疗效果。此外，研究揭示了TME中不同类型的TLS状态。激活型TLS与良好的预后相关，而低氧环境则抑制TLS的形成并与较差的预后相关。

| 所用数据

单细胞测序数据与空间转录组测序数据：未携带EGFR/ALK突变的可切除非小细胞肺癌（NSCLC）患者，这些患者接受了新辅助免疫化疗（PD-1抑制剂加铂类化疗）。根据病理学评估，6名患者被分类为治疗反应者（包括5名病理完全缓解（pCR）患者和1名主要病理反应MPR患者），剩余13名为非反应者（无主要病理反应NMPR）。
TCGA-LUAD 数据集：用于生存分析，获取了来自The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库的肺腺癌（LUAD）数据，包括基因表达矩阵和临床信息。
H&E图像数据：用于识别和分析肿瘤微环境的三级淋巴结构（TLS），结合空间转录组数据帮助识别不同阶段的TLS。

▲ 图1：该图展示了本研究的设计流程和实验数据分析结果。图中的a部分呈现了研究设计的工作流程；b部分提供了每位患者的样本信息，并通过点的表示法指示了每个实验的可用数据。c部分展示了所有232,080个细胞的UMAP图，颜色编码显示了主要细胞谱系的分布；d部分则细分为T细胞、B细胞、单核细胞/巨噬细胞、CD31−基质细胞、树突状细胞和内皮细胞的UMAP图，突出显示了不同亚群。e部分是上皮细胞的UMAP图，绿色和棕色分别代表正常和恶性细胞。f和g部分的箱形图分别展示了免疫细胞亚群和成纤维细胞亚群在三位反应者与四位非反应者的治疗前后分布变化，使用单侧Wilcoxon检验评估统计显著性。h部分展示了治疗前队列的NanoString GeoMx DSP空间转录组分析，标示了不同区域（肿瘤、边界、基质、淋巴细胞聚集）的选择。i部分展示了使用Visium（10x Genomics）进行空间转录组学分析的H&E染色图，来自接受免疫治疗的队列。

单细胞测序的组成与分布：

①上皮细胞：从64,947个上皮细胞中，基于拷贝数变异（CNVs）识别出两类主要簇，分别代表正常细胞和恶性细胞。免疫反应者中，恶性细胞在接受ICB-化疗后几乎被消除，而非免疫反应者仍然存在。
②免疫细胞：免疫细胞中，治疗后非反应者相比治疗前，单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞的比例显著增加。
③CD31−基质细胞：在基质细胞中，COL11A1+癌症相关成纤维细胞（CAFs）的比例在非反应者中显著高于反应者，表明这些细胞可能在影响ICB-化疗反应性中发挥重要作用。

| 研究发现

1. 鉴定与治疗反应相关癌细胞状态

作者将癌细胞分为14个亚群，并通过标注了它们的标志基因（Fig 2a）。随后，他们将癌细胞状态分为两组，一组包括：干扰素（IFN）、肺泡、雌激素、细胞外基质、凝血等状态；另一组包括：鳞状、NRF2靶标、细胞周期相关等状态（Fig 2c）。前者与生存正相关，后者与生存负相关（Fig 2d）。在免疫治疗中，NRF2靶标状态在治疗前的非反应者中显著高于反应者，而IFNγ状态则表现出相反的趋势，提示癌细胞的生物学特征可能影响免疫治疗的临床效果（Fig 2e-g）。在空间转录组学数据中，IFNγ得分与邻近免疫细胞（如单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞）的比例呈正相关，而NRF2靶标得分则呈负相关，提示癌细胞状态可能在肿瘤微环境中塑造免疫反应的多样性（Fig 2i）。

▲ 图2：展示了癌细胞状态与免疫检查点抑制（ICB）联合化疗反应之间的潜在关系。a部分为UMAP图，展示了按癌细胞状态着色的癌细胞分布。b部分为点图，显示了各癌细胞状态的代表性标志基因的平均表达和表达比例。c部分展示了癌细胞状态得分的皮尔逊相关性分析。d部分为棒棒糖图，显示了通过Cox回归分析，癌细胞状态与TCGA-LUAD队列患者临床结果之间的关联P值。e部分为箱形图，比较了治疗过程中反应者与非反应者的NRF2靶标（左）和IFNγ（右）得分。样本数量为：n=3（PreR），n=4（PreNR），n=6（PostR），n=13（PostNR），并使用单侧Wilcoxon检验评估统计显著性。f部分为火山图，比较了反应者与非反应者在肿瘤ROI中的P值调整和fold变化，使用双侧Wilcoxon检验确定统计显著性。g部分为箱形图，展示了反应者和非反应者在治疗前通过DSP数据测量的NRF2靶标（左）和IFNγ（右）得分的比较。h部分为癌细胞状态得分（包括NRF2靶标、IFNγ和相邻细胞类型）在Visium滑片中的皮尔逊相关性分析。i部分展示了P03样本中IFNγ得分、NRF2靶标得分及其相邻单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞在肿瘤微环境中的空间分布。

2. 空间转录组揭示肿瘤微环境中的细胞空间分布

作者使用了Visium空间转录组数据，并基于先前研究将定义了四种主要区域：肿瘤核心、侵袭边缘、孤立肿瘤和肿瘤基质区域（Fig. 3b）。随后，作者使用 STRIDE 工具，对Visium数据中的细胞类型进行了解卷积分析。他们发现，肿瘤核心区域主要由恶性细胞占据，而侵袭边缘和孤立肿瘤则包含恶性和非恶性细胞。肿瘤基质区域几乎不包含恶性细胞。

▲ 图3：展示了NSCLC在ICB联合化疗后的空间细胞组织情况。a部分左侧为组织采样示意图，右侧为H&E染色图，展示了在四种组织学定义类别（肿瘤核心（n=3）、侵袭边缘（n=1）、孤立肿瘤（n=2）和肿瘤基质区域（n=11））中基因计数分布和CAFs、淋巴细胞及恶性细胞的丰度。比例尺为1mm。b部分为细胞类型上下文定义的示意图，c部分为基于细胞类型上下文的15种空间转录组学斑点的UMAP图。d部分突出了恶性细胞、记忆B细胞、单核细胞/巨噬细胞、CD8+ T细胞、COL11A1+ CAFs和ADH1B+ CAFs在细胞类型上下文中的分布。e部分为细胞类型上下文的空间映射，展示了三种恶性细胞上下文、COL11A1+ CAF富集上下文和记忆B细胞富集上下文的空间分布。

无监督聚类将所有空间转录组学点根据细胞类型组成分类为15种组分（Fig. 3b，细胞类型组分特指每个 Spot 的聚类结果）。Fig. 3c,d 中观察到三种与恶性肿瘤相关的细胞类型组分（3、10和13），两种富含成纤维细胞的细胞类型组分（分别富含ADH1B+ CAFs和COL11A1+ CAFs），以及四种免疫细胞类型组分（1、7、9和12）。恶性相关的细胞类型组分3和13被COL11A1+ CAF富集的细胞类型组分8包围，表明肿瘤细胞与基质细胞在肿瘤边界发生相互作用（Fig. 3e）。细胞类型组分9中富含生发中心B细胞和CD4+ CXCL13+ T细胞，对应于淋巴细胞聚集的位置，表明免疫细胞在肿瘤微环境中的空间聚集（Fig. 3e）。以上内容表明，恶性细胞、成纤维细胞和免疫细胞的特定组合，以及其在肿瘤核心、侵袭边缘和基质区域中的不同位置可能影响到了免疫治疗反应和肿瘤进展。

作者还进一步分析发现，ADH1B+ CAFs表现出 iCAF 表型，参与代谢重塑和免疫反应；而COL11A1+ CAFs则表现出 myCAF 表型，支持肿瘤进展，通过促进低氧、TGFβ信号通路和糖酵解等途径增强肿瘤的生长。COL11A1+ CAFs的表达与肿瘤的侵袭性和较差的预后相关，提示它们可能在肿瘤微环境中发挥重要的促肿瘤作用（补充数据）。

3. COL11A1+ CAFs在肿瘤边界的积聚促进免疫逃逸

首先，作者进一步分析了COL11A1+ CAFs细胞的空间定位。COL11A1+ CAFs在非反应者的肿瘤边界区域富集，而在反应者中则表现出较低的比例（Fig 4a）。非反应者在肿瘤边界的CD8+ T细胞比例较低，COL11A1+ CAFs的比例较高，提示这些CAF可能在肿瘤边界抑制T细胞的浸润。COL11A1+ CAFs在肿瘤的边界聚集，但在远离肿瘤的基质区域显著减少。它们在肿瘤核心区域和侵袭边缘区域形成包围肿瘤细胞的结构，提示它们在肿瘤边界与肿瘤细胞相互作用。ADH1B+ CAFs则主要富集在肿瘤基质区域，但在孤立肿瘤边界几乎不出现。

▲ 图4：展示了COL11A1+ CAFs在NSCLC中的空间定位及其潜在的促癌作用。a部分为箱形图，显示了治疗前反应者（n=11）和非反应者（n=15）在肿瘤边界区域内T细胞和COL11A1+ CAFs的比例。b部分展示了P11（NMPR）样本中肿瘤斑点、COL11A1+ CAFs、ADH1B+ CAFs、DDR1、COL11A1和ADH1B的表达水平，以及DDR1–COL11A1共定位和胶原形成标记基因的空间分布。绿色点和绿色虚线框标示了肿瘤斑点和肿瘤区域。c部分展示了P08（NMPR）样本中肿瘤核心区域内COL11A1+ CAFs和ADH1B+ CAFs的空间分布，注意ADH1B+ CAFs未出现在富含肿瘤的区域。d部分展示了P03（NMPR）样本中肿瘤侵袭边缘区域内COL11A1+ CAFs和ADH1B+ CAFs的空间分布，比例尺为1mm。e部分展示了P11样本中恶性细胞与COL11A1+ CAFs之间的细胞间通讯网络。f部分为多重免疫荧光染色，显示了ICB-化疗后样本中COL11A1+成纤维细胞（COL11A1+和α-SMA+）和DDR1+恶性细胞的空间定位，比例尺为100μm。g部分为散点图，展示了在Visium空间转录组学队列中肿瘤细胞附近COL11A1+ CAFs与T细胞比例的皮尔逊相关性分析结果。h部分为TCGA-LUAD队列（治疗前）的散点图，显示CD8+ T细胞比例与COL11A1+ CAFs比例的相关性，红线表示回归模型。i部分为NSCLC队列单变量Cox回归分析的森林图，红点表示危险比（HR），黑线表示95%的置信区间。j部分为箱形图，显示了Stand Up To Cancer–Mark Foundation for Cancer Research子队列中治疗前反应者（R; n=14）和非反应者（NR; n=22）的COL11A1+ CAFs比例，使用CIBERSORTx估算。k部分为独立NSCLC队列中治疗前反应者（n=9）和非反应者（n=15）的COL11A1+ CAFs比例，l部分为黑色素瘤队列（GSE78220）中反应者（n=10）和非反应者（n=39）的COL11A1+ CAFs在所有成纤维细胞中的比例。

然后，作者分析了COL11A1+ CAFs与其他细胞的交互作用（Fig 4e）。① COL11A1+ CAFs的丰富程度与肿瘤细胞周围T细胞的浸润呈显著负相关，表明COL11A1+ CAFs可能通过占据肿瘤边界区域抑制免疫细胞的浸润。在治疗前，COL11A1+ CAFs的丰度与T细胞的浸润也呈负相关，进一步证明它们可能对免疫逃逸起到促进作用。② COL11A1+ CAFs与肿瘤细胞之间通过DDR1（Discoidin Domain Receptor 1）和COL11A1发生配体-受体相互作用，帮助促进胶原纤维的排列并阻碍免疫细胞的渗透。DDR1和COL11A1的共定位在肿瘤边界区域高度富集，但在远离肿瘤的区域显著减少，进一步表明它们在肿瘤微环境中的重要作用。

在临床层面，COL11A1+ CAFs的丰度与NSCLC患者的不良预后相关，尤其是在接受免疫检查点抑制（ICB）治疗的患者中，提示它们可能在免疫治疗的反应中发挥重要作用。在多个队列中（包括NSCLC和黑色素瘤队列），非反应者中COL11A1+ CAFs的比例显著高于反应者，表明其可能是ICB治疗反应性的有效预测标志物。

4. SPP1+巨噬细胞与COL11A1+ CAFs的协同作用可能是NSCLC肿瘤微环境免疫抑制的关键机制

研究发现COL11A1+ CAFs与SPP1+巨噬细胞之间存在显著的正相关，且两者在免疫治疗非反应者的肿瘤样本中都表现出较高的比例（Fig 5a）。SPP1+巨噬细胞和COL11A1+ CAFs都富集在肿瘤边界区域，而在远离肿瘤的基质区域则分布较为稀疏（Fig 5c-d）。具体而言，SPP1+巨噬细胞和COL11A1+ CAFs在肿瘤边界区域高度聚集，并通过SPP1-CD44配体-受体相互作用促进彼此的增殖与激活（Fig 5f）。SPP1由巨噬细胞分泌，促进了CAF的增殖和激活，并增加了胶原的沉积，从而加剧了肿瘤的免疫逃逸。在COL11A1+ CAFs丰富的肿瘤边界区域，T细胞的浸润显著减少，且SPP1-CD44的共定位水平也显著较低，表明SPP1+巨噬细胞与COL11A1+ CAFs可能通过抑制T细胞的浸润共同保护肿瘤免受免疫攻击。

▲ 图5：展示了SPP1+巨噬细胞与COL11A1+ CAFs共定位并阻碍T细胞浸润的机制。a部分为散点图，显示了在单细胞样本中COL11A1+ CAFs与SPP1+巨噬细胞比例之间的显著正相关。黑线表示回归模型，去除了帽值后的拟合结果。b部分为箱形图，展示了三位反应者与四位非反应者治疗前后SPP1+巨噬细胞的比例，使用单侧t检验评估统计显著性。c部分展示了P11（NMPR）样本中肿瘤斑点、SPP1+巨噬细胞、CXCL9+巨噬细胞、COL11A1+ CAF特异性表达的CD44、SPP1与CXCL9的表达及SPP1–CD44和CXCL9–CXCR3的共定位水平。d和e部分分别展示了P08（NMPR）和P03（NMPR）样本中的肿瘤核心和侵袭边缘区域的空间分布，含有SPP1+巨噬细胞和CXCL9+巨噬细胞。比例尺为1mm。f部分为通过CellChat推测的P08样本中SPP1+巨噬细胞与COL11A1+ CAFs之间的细胞间相互作用，突出了SPP1–CD44配体-受体对（红色文本）。g–i部分为箱形图，比较了在肿瘤边界（≤3个斑点）上，来自COL11A1+ CAF低区域（P03 ROI，n=166）和两种COL11A1+ CAF包围区域（P08（n=970）和P11（n=150））中的COL11A1+ CAFs比例（g）、T细胞比例（h）和SPP1–CD44的共定位水平（i）。使用双侧Wilcoxon检验评估统计显著性。j部分为TCGA-LUAD队列的Kaplan–Meier生存曲线，按照COL11A1+ CAFs和SPP1+巨噬细胞标志物得分对患者进行分组，生存曲线通过log-rank检验进行比较。k部分为来自另一NSCLC样本（P8T）接受ICB-化疗后的多重免疫荧光染色，显示了COL11A1+ CAFs（α-SMA+和FAP+）、SPP1+巨噬细胞（SPP1+和PanCK−）、T细胞（CD3+）和肿瘤细胞（PanCK+）的空间位置。比例尺为100μm。箱形图中的中心线表示中位数，下/上边缘分别为第25和第75百分位，胡须表示1.5倍四分位距。

在TCGA-LUAD队列中，具有较高COL11A1+ CAFs和SPP1+巨噬细胞水平的患者显示出最差的生存预后（Fig 5i）。这些细胞标志物的联合分析可以作为免疫治疗反应的预后标志物，帮助预测患者的生存期和免疫治疗效果。多重免疫荧光染色验证了SPP1+巨噬细胞和COL11A1+ CAFs的空间关系，表明这两种细胞在肿瘤边界的聚集，以及它们对T细胞的抑制作用（Fig 5k）。CXCL9+巨噬细胞（需要区分于前面的SPP1+）和细胞毒性免疫细胞在COL11A1+ CAFs的存在下未能进入肿瘤内部。

5. 不同TLS状态的分布和成熟度对肿瘤微环境中的免疫反应起着关键作用

作者使用PCA和K-means聚类分析，对不同成熟阶段的TLS进行了全面表征（Fig. 6a–c）。在TLS的免疫细胞组成与功能层面，研究表明，在不同成熟阶段的TLS中，生发中心B细胞、效应记忆CD4 T细胞和滤泡辅助T细胞在TLS的激活和功能中起着重要作用。记忆B细胞则与TLS的长期效应相关（Fig. 6d）。在TLS与免疫治疗反应的关系层面，非反应者的TLS分布在不同的成熟阶段上显示出明显的多样性，且在免疫治疗后，更多的激活型TLS与肿瘤残留量的减少相关，暗示激活型TLS可能具有抗肿瘤作用（Fig. 6e,f,g）。pCR患者的TLS数量较少，且几乎所有TLS都处于晚期阶段，提示反应者的免疫反应处于衰退状态（Fig. 6e）。激活型TLS与更好的预后相关，而晚期TLS则可能反映免疫反应的衰退。在NMPR患者中，晚期TLS表现出较高的HIF1A和ENO1表达，提示这些TLS处于低氧环境并参与糖酵解过程（Fig. 6h）。热休克蛋白（如HSP90B1和HSP90AA1）在晚期TLS的非反应者中也高度表达，进一步证明了晚期TLS可能处于应激环境中，这些TLS的功能可能受损。

▲ 图6：展示了TLS的不同阶段特征及其临床意义。a部分为PCA可视化图，展示了所有样本中TLS的分布。b部分为PCA可视化图，展示了与TLS相关的标志基因的表达情况。c部分为PCA可视化图，展示了对所有TLS进行k-means聚类和注释的结果。d部分为热图，展示了不同TLS状态下B细胞（左）和T细胞（右）亚群的富集情况。e部分为所有样本中不同TLS状态的分布。f部分展示了来自三位非反应者的肿瘤样本中不同阶段TLS的空间分布，比例尺为1mm。g部分为箱形图，比较了非pCR组中具有或不具有激活型TLS的患者肿瘤残留比例差异。h部分为火山图，展示了来自NMPR组和pCR组的晚期TLS中差异表达基因的比较，使用双侧Wilcoxon秩和检验评估统计显著性。i部分为条形图，展示了来自NMPR组与pCR组TLS中显著升高基因的基因本体生物过程（GO-BP）通路富集情况，颜色代表显著性。j部分为箱形图，展示了不同TLS状态中的低氧签名得分：淋巴样聚集（n=42）、激活型TLS（n=71）、衰退型TLS（n=103）、晚期TLS（pCR）（n=26）和晚期TLS（NMPR）（n=39），使用双侧Wilcoxon秩和检验评估统计显著性。k部分展示了另一个预处理NSCLC队列中激活型TLS得分与低氧签名得分的相关性，蓝线为回归线，灰色带表示回归线的95%置信区间，每个散点代表队列中的一个样本。l部分为箱形图，展示了另一个独立NSCLC队列中治疗前反应者（preR，n=9）与非反应者（preNR，n=15）之间的激活型TLS签名得分，使用单侧Wilcoxon秩和检验评估统计显著性。m部分为TCGA-LUAD队列的Kaplan–Meier生存曲线，根据激活型TLS签名对患者进行分组，通过log-rank检验比较生存曲线的统计显著性。

在TLS的低氧特征层面，低氧标志物的表达在不同TLS状态中有所不同，早期和衰退期TLS的低氧特征较强（Fig. 6j）。在另一组预处理NSCLC患者的队列中，激活型TLS得分与低氧签名得分呈正相关，进一步提示激活型TLS与低氧环境的关系（Fig. 6k）。在临床预后层面，激活型TLS的存在与更好的预后相关。研究通过Kaplan-Meier生存曲线分析发现，激活型TLS信号可以有效预测NSCLC患者在免疫治疗中的生存情况（Fig. 6m）。

| 总结

这项研究发现，COL11A1+ CAFs和SPP1+巨噬细胞通过抑制T细胞浸润促进肿瘤免疫逃逸。TLS的成熟状态与免疫反应密切相关，激活型TLS与更好的免疫治疗预后相关，而晚期TLS则可能反映免疫反应的衰退。低氧环境促进调节性T细胞浸润并抑制CD4效应T细胞，从而抑制TLS的激活。研究提示，针对肿瘤微环境（TME）中多个成分（如CAFs、巨噬细胞和TLS）进行治疗可能会增强免疫治疗的效果，为开发组合疗法提供了新的方向。