Iso-seq 必备基础

Iso-seq , 全称叫做 Isoform-sequencing, 是 Pacbio 公司对自己开发的转录本测序技术的规范化命名；是利用三代测序长读长的特点，不打断转录本，直接测序，从而得到全长转录本的一种测序技术。

对于iso-seq 的分析而言，必须掌握以下几个基本概念：

1）ROI

了解过三代测序数据分析的人，对于CCS 环形一致性序列的概念肯定不会陌生，在iso-seq中，提出了比CCS 更加灵活的一个概念：ROI

ROI , 全称 reads of insert，可以理解为插入片段，首先看下三代测序文库构建阶段的reads示意图：

对于上述的文库片段，测序产生的reads 示意图如下：

由于是一个环状分子， 随着测序反应的进行，会循环测序；如果把插入片段的正负链都测了一次，就做1个full pass;

对于CCS 而言，要求至少有2个full pass , 才能去生成CCS  reads; 三代测序的特点就是读长很长，可以达到十几kb, 对于短的插入片段而言，CCS这样定义当然没有问题，但是对于全长转录本

 而言，转录本长度很长，比如转录本长度1kb, 读长3kb, 此时在一个零模波导孔（ZMW）中测序的reads 就不可能达到2个full pass , 也就产生不了CCS reads, 为了解决这个问题，提高reads的利用率，提出了ROI 的概念，ROI 指的就是插入片段，上图测序reads 产生的ROI 如下：