CDS & ORF & 启动子 & 终止子 & 转录因子 & 基因结构 & UTR

ORF和CDS的区别

ORF的英文展开是open reading frame(开放阅读框)。

CDS的英文展开是coding sequences (编码区)。

CDS:DNA转录成mRNA,mRNA经剪接等加工后翻译出蛋白质,所谓CDS就是与蛋白质序列一 一对应的DNA序列,且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列,不考虑mRNA加工等过程中的序列变化,总之,就是与蛋白质的密码子完全对应.

ORF:理论上的氨基酸编码区,一般是在分析DNA核酸图谱中(主要是利用电脑程序)得到的。程序会自动在DNA序列中寻找启动因子(ATG或AUG),然后按每3个核酸一组,一直延伸寻找下去,直到碰到终止因子(TAA或TAG)。程序把这个区域当成ORF区,认为理论上可以编码一组氨基酸。

但问题是,在一个整体核酸序列中寻找ATG并不靠谱。因为寻找到的ATG很可能是两个氨基酸编码片段的尾和头的混合体。比如AACGCATGCAGC.

看上面这个小序列,如果以T为中心,会有三种编码组合的可能。即

(1)ATG(T在中心)电脑程序发现的启动因子的组合

(2)CAT(T在最右侧)

(3)TGC(T在最左侧)本例中实际核酸编码的组合。

这就是ORF三种框架的来源。实际上,DNA序列可以按六种框架阅读和翻译(每条链三种,对应六种不同的三联密码子)。

所以,我们说ORF只是理论上的编码区,与真实的情景可能并不一样。

而CDS是检查cDNA后得到的编码组合序列,和实际情景比较接近。

 

启动子与起始密码子、终止子与终止密码子有何区别?   
启动子与起始密码子、终止子与终止密码子看起来似乎差不多,实际上却是两组截然不同的概念,根本就没有共同点。

简单地说,启动子和终止子都是一段特殊的DNA序列,属于基因的非编码区,分别位于编码区的上游和下游,负责调控基因的转录。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三联体碱基序列,分别决定翻译的起始和终止。 
启动子——DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域,在许多情况下,还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。  

强启动子(strong promoter),指对RNA聚合酶有很高亲和力的启动子,它能指导合成大量的mRNA。
起始密码子——蛋白质翻译过程中被核糖体识别并与起始tRNA(原核生物为甲酰甲硫氨酸tRNA,真核生物是甲硫氨酸tRNA)结合而作为肽链起始合成的信使核糖核酸(mRNA)三联体碱基序列。大部分情况下为AUG,原核生物中有时为GUG等。  
终止子——转录过程中能够终止RNA聚合酶转录的DNA序列。使RNA合成终止。
终止密码子——蛋白质翻译过程中终止肽链合成的信使核糖核酸(mRNA)的三联体碱基序列。一般情况下为UAA、UAG和UGA,它们不编码氨基酸。

 

转录因子:转录因子(transcription factor)是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合,从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

转录因子的结合位点(transcription factor binding site,TFBS)是转录因子调节基因表达时,与基因模板链结合的区域。按照常识,转录因子(transcription factor,TF)的结合位点一般应该分布在基因的前端,但是,新的研究发现,人21和22号染色体上,只有22%的转录因子结合位点分布在蛋白编码基因的5'端。

 

UTR(Untranslated Regions)即非翻译区,是信使RNA(mRNA)分子两端的非编码片段。

5'-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子,3'-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的前端。

 

非编码区和编码区、启动子和终止子

 

非编码区和编码区、启动子和终止子

 

非编码区和编码区、启动子和终止子

 

参考:

非编码区和编码区、真核生物的启动子、终止子(好)

启动子分析 -- 转录因子结合位点

转载于:https://www.cnblogs.com/leezx/p/6268794.html

<think>嗯,用户之前问过如何根据CDS序列设计shRNA,现在他们特别想知道怎么用Geneious来做这个。我需要先回想一下之前提供的回答里有没有提到Geneious。之前的回答里确实在第二部分推荐了Geneious作为综合工具,但步骤是以BLOCK-iT为例的。现在用户可能对Geneious更感兴趣,或者他们手头有这个软件,需要具体的操作指南。 首先,我要确认用户的需求。他们可能需要一步步的指导,包括如何导入序列、设置参数、筛选结果以及验证。用户可能是研究人员或者学生,刚接触shRNA设计,所以需要详细但清晰的步骤,避免专业术语过多导致困惑。此外,用户可能希望了解在Geneious中的具体操作界面和注意事项,比如如何避免脱靶效应,如何导出结果等。 接下来,我需要回忆Geneious的功能。Geneious是一个综合的生物信息学软件,支持多种分析,包括序列比对、引物设计、shRNA设计等。设计shRNA通常涉及选择靶点序列,检查特异性,评估二级结构等步骤。在Geneious中可能有专门的插件或工具来处理这些任务,或者需要结合其他工具如BLAST来进行验证。 然后,我需要组织步骤。首先是如何导入CDS序列,确保格式正确。然后使用Geneious的shRNA设计工具,设置参数如GC含量、长度、避免特定序列模式。生成候选序列后,如何筛选,比如BLAST比对,二级结构分析。最后导出设计好的shRNA结构,可能涉及添加loop和终止子。 还需要考虑用户可能的误区,比如直接在mRNA的5'或3'端设计,或者忽略脱靶效应。所以要在步骤中强调这些注意事项。另外,实验验证部分也很重要,提醒用户即使软件设计合理,仍需实验确认。 可能还需要比较Geneious和其他工具的优势,比如集成化,不需要切换多个软件,但可能需要付费。用户可能关心是否需要额外插件或订阅,所以需要提前说明。 最后,确保回答结构清晰,分步骤讲解,每个步骤有操作细节和截图建议。可能需要建议用户参考Geneious的官方文档或教程链接,但用户可能没有访问权限,所以尽量提供自足的信息。</think>以下是使用 **Geneious Prime** 设计shRNA的详细分步指南,涵盖从序列导入到靶点验证的全流程: --- ### **一、导入CDS序列** 1. **获取目标基因的CDS序列** - 从 **NCBI** 或 **Ensembl** 下载已验证的CDS序列(确保为连续编码区,无内含子)。 - 格式要求:FASTA格式(例如:`>GeneX_CDS\nATGGCGAAACGT...TGA`)。 2. **在Geneious中导入序列** - 点击菜单栏 **File → Import → File**,选择CDS的FASTA文件; - 右键点击序列 → **Annotate & Predict → Add Translation**,确认开放阅读框(ORF)正确。 --- ### **二、启动shRNA设计工具** 1. **打开RNAi设计模块** - 选中目标CDS序列 → 点击顶部菜单 **Tools → Plugins → RNAi Design**(需确保已安装插件); - 若无RNAi插件,可改用 **Primer Design** 工具自定义靶点筛选。 --- ### **三、参数设置与靶点生成** 1. **设定靶点规则** - **靶点长度**:输入19-21 nt(默认21 nt); - **GC含量**:勾选 **30%~55%**; - **排除重复碱基**:勾选 **No runs of ≥4 identical bases**; - **靶点位置**:勾选 **Avoid 5'/3' UTR**(仅针对CDS区域)。 2. **生成候选序列** - 点击 **Design**,Geneious会自动扫描CDS,列出符合条件的靶点; - 输出结果包含: - 靶点序列(Sense strand); - 位置(如CDS 150-170); - GC含量与二级结构评分。 --- ### **四、筛选与优化靶点** 1. **特异性验证** - 右键点击候选靶点 → **BLAST → NCBI BLAST**; - 设置参数:数据库选择 **RefSeq mRNA**,勾选 **Short queries**; - **排除标准**:与非目标基因匹配≥16 nt的靶点。 2. **评估mRNA二级结构** - 选中靶点区域 → **Tools → Fold RNA**(使用默认能量参数); - 避免选择位于 **发夹结构茎部(stem)** 或 **高自由能区域(ΔG > -5 kcal/mol)** 的靶点。 3. **构建shRNA骨架** - **Sense链设计**:直接使用靶点序列(19-21 nt); - **Antisense链**:生成反向互补序列,并在3'端添加 **2-nt overhang**(如TT); - **Loop序列**:插入标准环结构(例如`5'-UUCAAGAGA-3'`)。 --- ### **五、导出shRNA载体序列** 1. **组装完整shRNA结构** - 在Geneious中新建DNA序列 → 手动输入以下结构: ``` 启动子(U6/H1) + sense链 + loop + antisense链 + 终止子(TTTTT) ``` - 示例: ```plaintext U6 promoter → GG[靶点序列]UUCAAGAGA[反向互补靶点序列]TTTTT ``` 2. **验证载体兼容性** - 使用 **Restriction Enzyme Cloning** 工具检查shRNA序列是否含意外酶切位点; - 调整序列避免与载体骨架冲突。 --- ### **六、实验验证建议** 1. **阴性对照**:设计针对无关基因(如EGFP)的shRNA; 2. **转染效率**:共转染荧光标记质粒(如pEGFP),观察转染率; 3. **功能验证**: - **qPCR**:检测mRNA水平抑制(建议48-72小时后); - **Western Blot**:验证蛋白表达下调(需根据蛋白半衰期调整时间)。 --- ### **七、Geneious设计优势与注意事项** | **优势** | **注意事项** | |-------------------------|-------------------------------------------| | 集成BLAST与结构预测 | 需手动添加终止子(TTTTT) | | 可视化靶点分布 | 部分高级功能需付费版本(如RNAi插件) | | 支持载体克隆设计 | 建议结合其他工具(如mFold)验证二级结构 | --- ### **操作示例截图示意** 1. **靶点生成界面**: ![Geneious RNAi设计界面](https://example.com/geneious_rnai.png) 2. **shRNA结构组装**: ![shRNA载体序列](https://example.com/shRNA_vector.png) 如需进一步演示具体步骤,可提供基因名称或序列进行实例分析! 🧬
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