RNAseq偏差基础知识汇总

探讨高通量测序中的偏差现象,包括位置偏差和序列偏差,及其对表达水平估计的影响。文章介绍了几种偏差校正方法,如NURD、mseq和POME,旨在提高测序数据的准确性。

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纯粹自我理解,参考一些论文概念后的心得,如果不对,感谢大神指点,不胜感激

1、是什么

其实就是测序所得数据与实际序列结果有一定成都偏离;

2、为什么

高通量测序,海 量的数 据 ,系统噪 声 ,数据偏差;

位置偏差 的 产 生 是 因 为 测 序 片 段 倾 向 于 来 自 转 录 本 的 起 始 位 置 ,而 序 列 偏 差 通 常 是 因 为 测 序 片
段 的 序 列 信 息 会 影 响 测 序 抽 样 过 程 。这 两 种 偏 差 被 认 为 是 已 知 偏 差 类 型 中 最 重 要 的 组 成 部

举个栗子下图基因ENSG00000154146和ENSG00000131095的读段分布具有明显的非均勻性质。读段的非均匀分布通常是由数据中不同偏差造成的,比如5端和3段 的位置偏差,GC碱基偏差以及其他技术性偏差

3、怎么办

针对此问题,不同方法采用了不同策略来消除偏差对表达水平估计的影响 。NURD使 用 非 参 数 模 型 估计 全局 偏 差 曲 线和 局 部 偏 差 曲 线,分别代表读段位置偏差对全部基 因 和 基 因 内 剪 接 异 构 体 的 影 响 ,其 定 量 值 被 当 做 权 重 嵌 入 到 泊 松 分 布 中。mseq通过线性模型来预测每个碱基位置周围序列的影响。POME方法考虑了碱基的变异性和碱基之间的相 关 性。 在 实 际 数 据 中 ,读段的非均匀分布通常是由各种偏差共同影响的,因此在表达水平估计中需要考虑更加复杂的偏差类型。
 

### RNAseq 实验结果复现方法 为了成功复现RNAseq实验的结果,理解并遵循一系列标准化的操作流程至关重要。这不仅涉及湿实验室中的样本处理过程,还包括干实验室的数据分析阶段。 #### 单细胞解离与分离 在准备用于RNA测序的生物样品时,确保所使用的单细胞解离和分离技术能够保持细胞活力,并最小化转录组的变化非常重要[^1]。不同的组织类型可能需要特定的酶促消化条件来实现有效的细胞释放而不破坏其mRNA含量。 #### 文库构建与质量控制 文库制备的质量直接影响最终数据分析的效果。应严格遵守制造商推荐的protocol进行cDNA合成、片段化以及接头连接等步骤。此外,在上机前需通过凝胶电泳或其他手段评估文库大小分布情况,确认无明显偏差后再送样至高通量测序平台。 #### 测序数据预处理 获得原始FASTQ文件之后,首先要做的就是去除低质量读取(reads),修剪引物序列和其他潜在污染源。可以利用Trimmomatic工具来进行这一系列清理工作: ```bash java -jar trimmomatic.jar PE \ input_forward_paired.fq.gz input_reverse_paired.fq.gz \ output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz \ output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz \ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36 ``` #### 参考基因组索引建立 对于后续比对而言,提前准备好目标物种经过适当版本更新后的参考基因组及其对应的GTF/GFF注释文件十分必要。STAR软件支持快速创建适用于大多数主流模式生物的索引数据库: ```bash STAR --runThreadN 8 --runMode genomeGenerate \ --genomeDir /path/to/genome/index \ --genomeFastaFiles /path/to/reference_genome.fasta \ --sjdbGTFfile /path/to/annotation.gtf \ --sjdbOverhang 99 ``` #### 序列比对与计数统计 完成上述准备工作后即可调用STAR执行高效而精确的短读长映射任务;接着借助featureCounts程序计算各特征区域内的表达水平变化趋势图谱: ```bash # 进行比对 STAR --genomeDir /path/to/genome/index \ --readFilesIn sample_R1.fastq.gz sample_R2.fastq.gz \ --outFileNamePrefix ./sample_ \ --outSAMtype BAM SortedByCoordinate # 统计counts featureCounts -T 8 -p -B -C \ -a /path/to/annotation.gtf \ -o counts.txt *.bam ``` #### 差异表达分析 最后一步则是运用DESeq2包实施差异表达检验,从而识别出那些显著上调或者下调的关键调控因子: ```r library(DESeq2) dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = cts, colData = coldata, design = ~ condition) dds <- DESeq(dds) res <- results(dds) write.csv(as.data.frame(res), file="results.csv") ``` 以上即为完整的RNA-seq实验结果复现指南,涵盖了从样本采集到最后得出结论所需经历的主要环节。
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