81、光谱精密距离共聚焦显微镜与基因组拓扑结构的三维分析

光谱精密距离共聚焦显微镜与基因组拓扑结构的三维分析

光谱精密距离共聚焦显微镜（SPM）

SPM为超结构荧光远场显微镜开辟了道路，使超越高分辨率显微镜的正常极限成为可能。这得益于强大的计算机硬件和复杂的图像分析算法，凸显了高精度光学与高端计算之间的紧密联系。

距离测量模拟与实验

• 计算机模拟 ：对双色共聚焦激光扫描显微镜中不同标记目标间距离测量的精度进行计算机模拟，考虑了光子噪声和色差确定误差等实验数据。假设了两种目标分布情况，模拟结果显示三维距离测定的标准偏差约为50nm，即有效半高宽（FWHM）的约十分之一，能正确测定不同光谱特征目标间远低于光学分辨率的三维距离。
• 实验测量 ：将具有不同光谱特征的石英玻璃珠混合并附着在盖玻片上，用商业共聚焦激光扫描显微镜进行三维成像。测量轴向色差并用于SPM距离测定，实验中SPM确定的平均三维距离值与预期值接近。更详细的SPM测量表明，在每个体素30到50个有效光子的范围内，横向距离误差约为20nm，轴向误差在50到75nm之间。

原位分辨率等效值（RE）的确定

SPM方法的准确性和有用的“分辨率等效值”（RE）取决于控制系统误差（如色差和单色像差）和统计误差（如光子统计、探测器噪声、机械不稳定性等）的能力。除了记录仪器的机械和光学参数外，复杂的计算机成像算法对获得最佳RE至关重要。
确定RE的步骤如下：
1. 假设细胞核中有一个“点状”目标用于校准，同时用两种光谱特征标记，使它们在物空间的荧光重心坐标相同。
2. 通过光学系统进行光谱区分记录