免疫荧光总是无信号？别忽略 PFA 固定液的这些关键问题

在免疫荧光实验中，不少研究者会遇到这样的困境：反复更换一抗、二抗，多次优化封闭和破膜步骤，但染色结果始终无信号或信号微弱。此时，问题可能并非出在后续操作，而是起始步骤中PFA 固定液的制备或使用不当。本文将从 PFA 的成分本质、固定原理、配制方法到存储注意事项，全方位解析 PFA 固定液在免疫荧光实验中的关键作用，帮你避开常见误区。

一、澄清误区：PFA 固定液中真正起作用的是什么？

很多实验者对 PFA 固定液存在认知误区：PFA 溶液中起实际固定作用的并非多聚甲醛（PFA）本身，而是其解聚产物甲醛。
多聚甲醛（CAS 号：66455-31-0）是甲醛的聚合物，本身难溶于水；但在加热（通常 55℃左右）和碱性条件下，PFA 会发生解聚反应释放出甲醛，而甲醛才是实现样本固定的核心成分。这就像 “老婆饼里没老婆”，PFA 更像是甲醛的 “储存形式”，其最终作用依赖于解聚产生的甲醛。

二、甲醛固定的核心原理：为什么免疫荧光离不开它？

甲醛之所以能成为免疫荧光实验中常用的固定剂，核心在于其化学交联作用：
甲醛通过与细胞或组织中的生物大分子（如蛋白质、核酸）发生交联反应，稳定样本的三维结构，防止生物成分因降解或流失而破坏天然形态；同时，这种交联能保留目标抗原的理化特征（如电荷、抗原表位、特异性结合位点），确保后续一抗、二抗能准确识别并结合目标分子，为染料的均匀渗透和特异性染色提供基础。
若固定不充分或固定液失效，样本会因结构崩解、抗原流失或理化性质改变，直接导致染色失败。

三、4% PFA 固定液的标准配制步骤（附关键细节）

4% PFA 是免疫荧光实验中最常用的固定浓度，其配制过程的规范性直接影响固定效果，以下是详细步骤及注意事项：

1. 基础溶液准备：取 200mL 超纯水（ddH₂O）倒入广口瓶，加入磁力搅拌子，滴加 1mL 1mol/L NaOH 溶液，磁力搅拌至均匀（碱性环境促进 PFA 解聚）。
2. 溶解 PFA 粉末