生物信息复习笔记（2）——测序基本概念

Intron：内含子，不参与编码。

Exon：外显子。

在剪切子作用下，内含子会被剪切掉，只留下外显子部分，pre-mRNA成为成熟的mRNA，参与后续多肽以及蛋白质的合成。

mRNA可逆转录成cDNA。

测序时，用于测序的打碎的cDNA片段只可能是基因外显子部分。每次对一个cDNA片段进行一次测序称之为一个测序的read。一个基因所有read的总数称为count

fpkm，tpm等是对count数值进行标准化后得到的。

为什么标准化：如基因A和基因B，基因A的count比基因B的count高不能直接说A的表达比B的高，可能只是因为基因A比较长。（基因包含的碱基越多，就越长，匹配到这个基因上面的DNA片段就越多。

如基因A在样本1和样本2中，在样本1中count比在样本2中间中高，也不能说A在样本1中的表达比在样本2中高。（在PCR扩增时如果对样本1多扩增了一些，导致样本1中的DNA片段更多）

为什么标准化：我们无法直观的通过比较counts数值的大小来知道基因表达的差异。

转录本：剪切体在剪切pre-mRNA时，有多种不同的剪切方法，不同的剪切方法产生不同的转录本。

基因长度：通常用c.非重叠外显子长度之和。

测序深度：加入到测序仪器中的DNA片段越多，测序深度越大。

标准化：

RPK（read per k）（每千个碱基的read数）：基因的count值除以基因的长度。*10的3次方是为了方便计算。

基因A的RPK=4，B的RPK=6

得出结论：在该样本中基因A表达量小于基因B

RPKM：（单端测序中使用）平衡掉基因长度影响后，再平衡测序深度的影响。（即在某个样品中，某基因的counts值除以该基因长度，再除以该样本所有基因的counts值的和。）*10的9次方方便计算

测序深度的平衡，靠counts值除以所有基因的counts值的和，即表示该基因在该样本中所有基因的占比。

不能用RPKM进行组间比较（即样本1与样本2的比较）

得出结论：样本1中A的表达量高于B。

FPKM（Fragment per million）（用于双端测序）：Fragment是read1和read2的连接。公式与RPKM一致。

TPM：（既能组间比较，又能组内比较）（基本都用TPM）

CPM：（用的不多）（只能用于组间比较）

总结：

生信分析很多时候只能输入counts值，因为很多R包有自己的一套标准化算法。