IF 23.8|构建MAG Calalog，病原微生物分析新趋势！

宏基因组基因目录（Catalog）是一个综合性的数据库，旨在汇总和分析特定环境中所有微生物的基因信息。这一目录通过利用大量的宏基因组数据，能够有效表征该环境中微生物的特征和功能，是微生态研究中不可或缺的重要工具。

近期，江西农大黄路生院士团队从猪肺炎支原体病原微生物分析的角度出发，首先构建了猪下呼吸道微生物宏基因组基因集（Catalog），进一步通过宏基因组binning，从下呼吸道微生物宏基因组数据中重建了MAG，构建了MAG Catalog，为我们提供了一个创新的新思路。

研究方法

样本类型：支气管肺泡灌洗液和气管灌洗液

测序项目：宏基因组+宏基因组binning+细菌完成图+原核转录组+互作转录组测序 

研究思路与亮点

图1 研究思路示意图

01、使用来自5个队列中的675头表型良好的猪的下呼吸道微生物样本的744份高深度宏基因组测序数据构建了肺部微生物宏基因组基因集（catalog），包含迄今为止规模最大的10,031,593个非冗余基因，其中44.8%是新基因。

02、获得了356个宏基因组组装基因组（MAGs），并进一步聚类在256个物种级的基因组bins中，其中41.8%在当前数据库中首次报道。

03、基于宏基因组基因集（Catalog）和MAG Catalog，研究通过对相关菌株的分离、体外感染和RNA测序的综合分析，鉴定并证实了猪肺炎中菌原体（猪肺炎支原体）MAG_47及其粘附相关毒力因子（VFs）与猪的肺病变相关。 

主要结果

1、猪下呼吸道微生物群综合基因目录的构建

本研究共收集到来自5个具有广泛代表性猪群675头猪的670份支气管肺泡（BAL）灌洗液样本和74份气管灌洗样本。基于宏基因组测序，采用单样本组装与所有测序样本共同组装相结合的策略。将所有预测到的基因根据氨基酸序列同源性分为100.0%、90.0%和50.0%三个聚类，构建了非冗余基因集，分别得到基因集PRGC100、PRGC90和PRGC50。通过对这三个基因集进行比较，结果显示，在PRGC90中，鉴定的物种分类群数量仅减少了1.0%。因此，PRGC90作为后续分析的基因集，包含迄今为止规模最大的10,031,593个非冗余基因，其中44.8%是新发现的基因。

图2 猪下呼吸道微生物组的综合基因目录及其分类组成和潜在功能能力的构建

2、猪下呼吸道微生物群MAGs的构建

研究通过宏基因组binning，重建了1965个完整度≥为50.0%和污染度≤10.0%的MAGs。去冗余之后得到了356个非冗余MAG。355个MAGs被分类注释为细菌，涵盖15个门，另一个MAG被注释为Methanobrevibacter A sp900769095（Methanobacteriota），一种产甲烷古菌。系统发育树结果表明，被注释为变形菌门的MAG具有较高的系统发育多样性。 

图3 构建猪下呼吸道微生物组的宏基因组组装基因组（MAGs）

3、通过整合微生物基因集和MAG Catalog来鉴定毒力因子基因（VFGs）及其宿主细菌

基于VFDB数据库注释，在PRGC90中注释到了17,144个毒力因子基因（VFGs），包括了1162种VF类型和14种VF功能类别。研究进一步将VFGs的序列与UniProt TrEMBL数据库进行比对，以确定其潜在的宿主细菌。在属水平上，有17144个VFGs广泛分布于30门的559个细菌属中，特别是假单胞菌和不动杆菌。

4、识别与肺部病变相关的细菌分类群和潜在的功能能力

本研究对613头F7猪的BAL样本进行了分析，根据肺部病变指标将其分为4组。alpha多样性结果表明，HL组的α多样性最高，且随着肺部病变程度的加深，α多样性显著下降。Beta多样性结果显示，4组间微生物组成差异显著。Lefse分析确定了与肺病变相关的微生物种类。4个猪组间共有27种细菌的丰度存在显著差异，进一步构建了一个共现网络来确定上述27个差异种之间的关系。

图4 识别与肺部病变相关的细菌分类群和潜在的功能能力

5、在猪肺炎支原体菌株中的泛基因组和VFs的分布

从1965个MAGs的注释结果中，研究发现数量最多的MAGs为猪肺炎支原体，因此研究基于291个猪肺炎支原体基因组进行泛基因组分析，获得了393个核心基因和3136个泛基因。基于393个核心基因的多序列比对，构建了最大似然系统发育树，发现公共数据库中的基因组跨越了有限的系统发育空间，而MAGs则表现出广泛的系统发育结构。

基于15个猪肺炎支原体菌株鉴定了71种VF类型，菌株间没有显著差异，但几乎所有15个基因组都携带大量编码黏附蛋白和黏附相关蛋白VFG，ABC转运体和capsule蛋白的VFGs。为了进一步比较VFG的转录水平，研究挑选了2株猪肺炎支原体菌株进行了转录组测序分析。

图5 猪肺炎中原菌株的泛基因组和毒力因子的分布

6、通过体外感染支气管纤毛上皮细胞和基因表达分析，阐明猪肺炎支原体致猪肺病变的机制

为了证实猪肺炎支原体菌株在猪肺病变和疾病中的作用，研究进一步从样本猪中分离出初代猪支气管上皮细胞（BEC），同时结合上述2株猪肺炎支原体菌株进行体外感染实验、免疫荧光染色、qPCR、转录组测序等。结果表明，M. hyopneumoniae感染通过增加免疫和炎症反应、氧化应激和细胞凋亡相关基因的表达水平，破坏BEC纤毛，破坏上皮细胞细胞屏障。猪肺炎支原体菌株间粘附能力和致病性的差异可能是由于与粘附和免疫逃避相关的细菌基因表达水平的差异，导致了与炎症反应、氧化应激和细胞凋亡相关的宿主基因表达水平的差异。

图6 通过体外感染支气管纤毛上皮细胞（BECs），阐明猪肺炎中菌原菌引起猪肺病变的机制及基因表达分析

该文章为我们详细的展示了如何构建一个物种特殊部位的MAG Catalog，以及如何基于MAG Catalog进行病原微生物的深入分析，例如功能基因与宿主的关联分析、群体特异性核心物种分析、病原微生物与疾病间的关联分析、病原微生物泛基因组分析等，为我们提供了一个新的研究思路。

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参考文献

Comprehensive lung microbial gene and genome catalogs assist the mechanism survey of Mesomycoplasma hyopneumoniae strains causing pig lung lesions. iMeta, 2024.