【卡梅德生物】蛋白质N端测序实验常见问题及解决方案

1.蛋白质N端测序要求样品的纯度是多少？

样品纯度不能太低，一般认为纯度大于90%的蛋白才适用于测序反应。

2.蛋白质N端测序对样品有什么特殊要求？

一般要求100-200ug蛋白，纯度>95%，胶内样品和溶液样品均可以用来进行蛋白质N端测序；PVDF转膜样品，考马斯亮蓝R250染色，每条泳道的样品尽量用最高浓度样品，上最大体积（尽量使条带长胖为正常的 2-3 倍宽度）；在电转印中使用的缓冲液尽可能不含甘氨酸；修饰封闭：N 端未被封闭；无干扰物：蛋白酶、氨基酸、胺、盐分、乙醛、去污剂等。

3.常见影响测试的情况有哪些？

（1）样品纯度不足；

（2）含盐过多导致无结果，甚至损坏仪器；

（3）样品量太少导致无结果；

（4）若蛋白质出现糖基化或N端被封闭，不能用此方法进行测试。

4.Edman降解法能够对所有蛋白质进行测序吗？

Edman降解测序法的优势是能够对未知的蛋白质进行测序，目前这项技术已经近乎完善，但是Edman也有一定的局限性。例如，Edman讲解法测序不能够解决蛋白质N端环化、封闭的测序问题，另外被修饰的蛋白质不能给出确切的信号，这些都在一定程度上限制了Edman降解法的广泛应用。

5.对未知的蛋白质来说，如果蛋白质的N端有环化封闭现象，或者N端有未知修饰时，如何对蛋白质序列进行准确分析呢？

对于序列未知的蛋白质，特别是经过改造后的重组蛋白质，体外合成蛋白质，以及改造的抗体，或者基因序列未被研究过的蛋白质，这类蛋白质的信息往往不包含在蛋白质数据库中。要实现对这类蛋白质序列的准确分析就必须通过蛋白质从头测序的方法，也是先将蛋白质酶切成小的多肽片段，接着经由高效液相色谱对多肽片段进行分离，再依次通过两级质谱对多肽片段序列进行测定。蛋白质从头测序不需要借助任何蛋白质数据库，可以对任何蛋白质，包括突变、经过生物改造的非天然蛋白质等进行测序。

6.Edman降解测序是否可以测定含有大概130多个氨基酸的未知蛋白？

130个氨基酸序列比较长，已经超出了蛋白质Edman测序的限度，建议使用蛋白从头测序对蛋白质序列进行测定。

参考文献

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