【技术应用】双荧光-minigene：将RNA剪接转化为红绿光信号的高通量筛选工具

这篇文章的核心内容是作者构建了一套双荧光-minigene报告系统，检测VEGF-A选择性剪接变化，并筛选抗血管生成作用的小分子化合物。下面我将从研究背景、方法、结果三个方面为您详细解析。

01 研究背景

VEGF-A（血管内皮生长因子A）是一个关键的血管生成调控因子。其第8号外显子的选择性剪接会产生两种功能相反的蛋白亚型：

①VEGF-Axxxa：促血管生成（pro-angiogenic）；

②VEGF-Axxxb：抗血管生成（anti-angiogenic）。

这两种亚型的平衡在癌症、糖尿病肾病等疾病中失衡，导致病理性血管生成。因此，通过小分子调控VEGF-A剪接偏向VEGF-Axxxb，有望成为一种新的抗血管生成治疗策略。

02 双荧光-minigene系统构建原理

研究人员把VEGF-A的intron7+exon8的关键序列拼接到一个双色荧光报告基因里，让细胞自己“决定”剪接位点，然后用颜色来“读出”决定结果。

如果细胞选择近端位点,读码框遇到dsRED后面的终止密码子，翻译提前终止，只有dsRED红色荧光-代表促血管生成VEGF-Axxxa。

如果细胞选择远端位点,读码框移位（+1），dsRED与EGFP融合表达，产生绿色荧光-代表抗血管生成VEGF-Axxxb。

图1 双荧光-minigene系统的构建原理（Star E and Stevens Ml., 2021）。

03 研究背景

图A为荧光显微镜拍摄：瞬时vs稳定转染HEK293。左列为瞬转的细胞，看到红色+绿色同时亮，在瞬转状态下细胞会兼具两种剪接机制。右列为稳转细胞，只剩红色。和内源 VEGF-A一样，HEK293细胞天然就只用近端位点，报告基因复现了这一偏好。

图B为RT-PCR验证剪接产物大小，只用近端位点时，PCR得到一条带（对应dsRED），没有EGFP带，与显微镜结果一致。

图C为流式细胞术（FACS）检测，稳定转染细胞几乎100 %落在红色通道（右图红色峰），绿色几乎为零。灰色阴影是未转染背景，证明红色信号来自报告基因，而非自体荧光。

图D为VEGF-A在Podocyte细胞的剪接验证，正常增生型podocyte（已知高表达VEGF-A165b）报告基因呈现几乎纯绿色（EGFP），符合其“偏好远端位点”的预设立场。Denys-Drash综合征podocyte（只表达VEGF-A165a）只红不绿，再次证明报告基因能随细胞背景切换剪接位点。

图E为抑制剂干预，用三种VEGF-A抑制剂（SRPIN340、SPHINX、SPHINX7）处理稳定表达报告基因的HEK293，三种药物均能改变VEGF-A剪接方式。

图F为RT-PCR验证剪接条带，药物处理后，EGFP条带明显增强，dsRED减弱。

图G为Western blot检测内源VEGF-A蛋白，抑制剂提高VEGF-A165b/total VEGF-A165比值（只在高效抑制剂 SPHINX 达统计学显著）。说明：报告基因的变化确实平行于内源蛋白水平。

图2 双荧光-minigene系统在细胞中的验证（Star E and Stevens Ml., 2021）。

双荧光minigene把“RNA剪接事件”翻译成“红/绿光信号”，兼具机制研究与高通量筛选双重价值，已成为解析可变剪接调控网络及发现剪接靶向药物的有力工具。 

参考文献

Star E, Stevens M,Gooding C, et al. A drug-repositioning screen using splicing-sensitive fluorescent reporters identifies novel modulators of VEGF-A splicing with anti-angiogenic properties[J]. Oncogenesis,2021,10(5): 36.