AbMole小课堂丨Hygromycin B：从原核到真核，全面解析潮霉素B在抗性筛选中的应用

Hygromycin B（潮霉素 B）是一种由吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）产生的氨基糖苷类抗生素，具有广谱的蛋白合成抑制活性，广泛应用于分子生物学和细胞工程领域。其作用机制主要通过干扰核糖体的易位过程，从而抑制原核及真核生物中的蛋白翻译。由于其可被抗性基因（如hph）编码的磷酸转移酶失活，Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素B，AbMole，M2761）已成为基因工程研究中重要的筛选工具，尤其在构建稳定转染细胞株、转基因动物模型及植物遗传转化等研究中具有重要应用。AbMole为全球科研客户提供高纯度、高生物活性的抑制剂、细胞因子、人源单抗、天然产物、荧光染料、多肽、化合物库、抗生素等科研试剂，全球大量文献专利引用。

一、Hygromycin B（潮霉素 B）的作用机理

Hygromycin B（潮霉素 B，AbMole，M2761）可通过结合核糖体 A位点，增强tRNA与核糖体的结合，从而阻断肽链延伸过程中的易位，抑制蛋白质合成。此外，Hygromycin B还可诱导mRNA的错读，进一步干扰翻译过程。Hygromycin B在细菌、酵母、植物细胞和哺乳动物细胞中均表现出抑制活性[1, 2]。

二、Hygromycin B（潮霉素 B）的科研应用

1. Hygromycin B（潮霉素 B）在原核细胞抗性筛选中的应用

Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素 B，AbMole，M2761）可用于原核系统的筛选。hph 和 aphIV是常用的Hygromycin B的抗性基因。hph基因，即潮霉素B磷酸转移酶基因，可以对Hygromycin B进行磷酸化修饰，使其失去核糖体结合能力。实验人员可以利用DNA重组技术将外源基因整合到含有hph 或 aphIV的质粒载体上，当该质粒被转化进入细菌（如大肠杆菌）后，通过在生长培养基中加入适当浓度的Hygromycin B，可以有效地抑制不含有该质粒的菌落生长。这使得研究人员能够高效地筛选出成功转化了目标质粒的菌株，用于后续实验。2014年，AbMole的两款抑制剂分别被西班牙国家心血管研究中心和美国哥伦比亚大学用于动物体内实验，相关科研成果发表于顶刊 Nature 和 Nature Medicine。

​图 1. 带有潮霉素B磷酸转移酶基因的载体

2. Hygromycin B（潮霉素 B）在构建稳定转染细胞株中的应用

Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素 B，AbMole，M2761）是筛选稳定转染细胞株的强有力工具。将潮霉素抗性基因（hph）与目的基因共同构建于同一质粒载体上，并将其导入哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中。之后使用含Hygromycin B（潮霉素 B，AbMole，M2761）的培养液进行长期筛选。未成功整合外源基因及抗性基因的细胞因缺乏保护机制，其蛋白质合成被抑制而死亡；而成功整合了抗性基因的细胞则能够存活并增殖，最终形成稳定的细胞系。潮霉素 B已成为研究细胞功能、基因过表达、RNA干扰等实验的常用抗生素。此外，在一些复杂的实验设计中，研究人员常利用多种抗性基因进行多重筛选。例如，将潮霉素与G418联合使用，可以筛选同时表达两个独立外源基因的细胞株，这对于研究蛋白相互作用或协同效应至关重要[3]。

3. Hygromycin B（Hygrovetine）在转基因动物与植物模型开发中的应用

在模式生物的开发中，Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素 B，AbMole，M2761）同样扮演了关键角色。在构建转基因小鼠、线虫（如C. elegans）或其他模式生物时，hph基因可作为有效的遗传筛选标记。通过显微注射或其他方法将构建好的转基因元件导入受精卵细胞后，在后续的培养或筛选中加入Hygromycin B，可以方便快捷地鉴定出成功整合了外源基因的细胞，大大提高了构建转基因动物模型的效率。在植物生物学领域，Hygromycin B被广泛用于筛选转化后的植物细胞和组织。农杆菌介导的转化或基因枪法转化后，植物组织在含Hygromycin B的培养基上生长，只有成功表达了hph基因的细胞才能发育成完整的抗性幼苗，从而获得转基因植株。这对于作物基因功能研究和育种工作具有重要意义。

三、范例详解

J Med Chem. 2023 Dec;17138–17154.

兰州大学、徐州医科大学的研究团队在上述文章中以先前发现的神经肽 FF受体多功能激动剂 DN-9 为基础，设计并合成了7种订书肽（Stapled Peptides）类似物，并通过多维度实验评估它们的活性，最终筛选出最优候选活性分子。实验人员以 DN-9为母肽，通过引入α-烯基氨基酸并进行关环复分解（RCM）反应合成 7 种全烃订书肽。在体外实验中，科研人员通过钙动员实验评估订书肽对 MOPr、κ-阿片受体（KOPr）、δ- 阿片受体（DOPr）及NPFF₁R、NPFF₂R的激动活性；在小鼠血浆和脑匀浆中测定代谢稳定性，计算降解半衰期。在体内实验中，科研人员采用甩尾实验评估皮下（s.c）、脑室内（i.c.v.）和口服（p.o）给药后的镇痛活性及持续时间；通过药理学实验（如使用受体拮抗剂）明确镇痛作用机制；借助旋转杆实验、胃肠道转运（GIT）实验、条件性位置偏爱（CPP）实验、纳洛酮诱发戒断实验及全身体积描记法，评估运动损伤、便秘、成瘾性和呼吸抑制等副作用；通过药代动力学研究（LC-MS/MS）分析最优化合物的血脑屏障穿透能力。研究人员在进行体外钙动员实验时，为了筛选稳定表达阿片受体及神经肽FF受体的CHO细胞，使用了由AbMole提供的Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素 B，AbMole，M2761），筛选浓度为100 μg/mL[4]。

图 2. 7种订书肽的体内实验结果[4]

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参考文献及鸣谢

[1] Linda Gritz, Julian %J Gene Davies, Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, 25(2-3) (1983) 179-188.

[2] M Dutt, JW %J Plant cell reports Grosser, An embryogenic suspension cell culture system for Agrobacterium-mediated transformation of citrus, 29(11) (2010) 1251-1260.

[3] Robert F Santerre, Jenna D Walls, Brian W Grinnell, Use of vectors to confer resistance to antibiotics G418 and hygromycin in stably transfected cell lines, Gene Transfer and Expression Protocols, Springer1991, pp. 245-256.

[4] M. Zhang, B. Xu, N. Li, et al., All-Hydrocarbon Stapled Peptide Multifunctional Agonists at Opioid and Neuropeptide FF Receptors: Highly Potent, Long-Lasting Brain Permeant Analgesics with Diminished Side Effects, J Med Chem 66(24) (2023) 17138-17154.