活细胞标记及其在体内外的长时示踪成像、细胞增殖检测是很多课题研究中的重要环节之一，传统方法在精准度、持续性和多维度分析上存在局限，难以满足复杂实验需求。CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）作为一款荧光素类化合物，具有高效、灵敏、低细胞毒性等优势，也是细胞示踪分析、细胞增殖检测的重要荧光染料。AbMole为全球科研客户提供高纯度、高生物活性的抑制剂、细胞因子、人源单抗、天然产物、荧光染料、多肽、靶点蛋白、化合物库、抗生素等科研试剂，全球大量文献专利引用。
一、CFDA-SE（CFSE）的作用机制
CFDA-SE（AbMole，M5117），即5-羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE），本身是一种可穿透细胞膜的非荧光性化合物。但当它进入细胞后，胞内的酯酶会将其水解，脱去乙酸盐基团，进而生成具有高度荧光性的5-羧基荧光素（5-carboxyfluorescein，CF），其激发和发射分别为500nm/520nm。此外，CF分子上的琥珀酰亚胺酯基团能够与细胞内蛋白质的氨基发生共价结合，使得CF保留在细胞内。在细胞进行分裂时，荧光CF分子会平均分配到子代细胞中，这种特性使其成为细胞标记和增殖检测的理想探针。
图 1. CFDA-SE的检测细胞增殖的原理
二、CFDA-SE的科研应用
1. CFDA-SE（CFSE）用于细胞增殖检测
一般经过CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）处理的细胞，可以直接在显微镜下观察（宽场荧光显微镜或者激光扫描共聚焦显微镜），由于死细胞中酯酶活性丢失，因此只有活细胞会产生CF荧光。此外，可以结合流式细胞术对细胞的增殖分裂情况进行定量分析，CF标记的细胞每分裂一次其子代细胞的荧光会减弱一半，如果细胞没有分裂则荧光强度最高，如相对荧光强度为50%则表明分裂1次，25%则表明分裂2次，以此类推。实验人员通过荧光强度对细胞进行分群和量化统计，可以有效地追踪细胞的分裂次数，从而评估细胞的增殖能力，或者结合细胞分选以获得具有强分裂能力的细胞用于后续实验[1]。CFDA-SE也可以结合碘化丙啶（PI，AbMole，M5108）分别进行活细胞和死细胞的染色，这与Calcein-AM/PI活死细胞染色试剂盒（AbMole，M55257）的原理是相同的，可以有效区分活死细胞比例，适用于荧光显微镜和流式细胞术等实验。2014年，AbMole的两款抑制剂分别被西班牙国家心血管研究中心和美国哥伦比亚大学用于动物体内实验，相关科研成果发表于顶刊 Nature 和 Nature Medicine。
图 2. 基于CFDA-SE的PBMC增殖检测[2]
2. CFDA-SE（CFSE）用于外泌体染色
外泌体是细胞分泌的直径为30~150 nm的胞外囊泡，可以运送多种生物活性分子（如RNA、脂质和蛋白质），介导细胞间的信息交流。CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）可以穿过外泌体的膜结构，进入外泌体内部，能用作外泌体在细胞和动物研究中的示踪剂。例如可以用CFDA-SE标记小鼠肺上皮细胞衍生的外泌体，将外泌体与小鼠骨髓细胞共培养后，发现小鼠骨髓细胞能够摄取肺上皮细胞外泌体[3]。
图 3. CFDA-SE标记的外泌体（绿色荧光标记）被小鼠骨髓细胞内吞[3]
3. CFDA-SE（CFSE）用于动物体内的细胞示踪成像
CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）同样可用于动物体内的成像分析，可以先将要标记的细胞在体外和CFDA-SE一同孵育，然后通过静脉注射或局部注射的方式移植到动物体内。CFDA-SE标记的细胞可以在动物体内监测数周，特别适合长期观察细胞的动态变化。例如CFDA-SE常用于淋巴细胞的体内示踪实验。通过标记小鼠脾细胞并输注到受体小鼠体内，可以观察到标记细胞在小鼠外周血、淋巴结和其他组织中的分布。此外CFDA-SE也可用于标记肿瘤细胞，研究肿瘤细胞在体内的迁移和分布。
图 4. CFDA-SE-labeled T-cells homed specifically to the white pulp of spleen[4]
三、范例详解
1. Adv Sci (Weinh). 2025 May;12(17):e2409870.
南京医科大学鼓楼医院在上述文章中研究了骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）细胞衍生的迁移体（Migrasomes, 由迁移细胞产生的囊泡）在骨肉瘤进展中的作用。研究发现OS细胞产生的迁移体（OCDMs）通过促进巨噬细胞的M2极化来加剧骨肉瘤的增殖和转移。通过进一步探究，实验人员证实了MFGE8是OCDMs中的关键蛋白，通过敲低MFGE8，可以抑制OCDMs的促肿瘤作用。在文章中，AbMole的CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117）被用于标记骨肉瘤细胞，以便研究巨噬细胞对这些细胞的吞噬能力[5]。
图 5. Flow cytometry analysis of the proportion of BMDMs (APC) that phagocytose apoptotic OS cells (CFDA-SE) and quantitative analysis[5]
2. Cancer Lett. 2023 Aug 1;568:216278.
河北医科大学在上述论文中开发了一种基于迷你圈DNA（Minicircle DNA, mcDNA）快速生成CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）的技术，并评估其在白血病中的抗肿瘤活性和安全性。研究结果表明，使用mcDNA生成的CD19 CAR-T细胞在体外和体内模型中均显示出与病毒载体生成的CAR-T细胞相当的抗肿瘤效果，并且避免了CAR-肿瘤细胞（CAR-expressing tumor cells）的产生。在实验中，科研人员使用了由AbMole提供的CFDA-SE（CFSE，AbMole，M5117），用于标记经过mcDNA转染的CD19 CAR-T细胞，通过流式细胞术检测细胞数量和CAR表达的变化，评估细胞的增殖能力。上述实验结果表明，mcDNA-CD19 CAR-T细胞在经过一段时间的培养后，其增殖率逐渐增加，与正常T细胞和病毒载体转导的T细胞相当[6]。
图 6. Proliferation curves of normal T, lentivirus CAR-T, and mcDNA-CAR-T cells[6]
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参考文献
[1] Y. M. Tan, J. Hou, X. J. Yang, et al., [Effects of intracellular Porphyromonas gingivalis on proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells in vitro], Nan fang yi ke da xue xue bao = Journal of Southern Medical University 36(4) (2016) 525-31.
[2] T. S. Dalgaard, L. R. Norup, D. Rubbenstroth, et al., Flow cytometric assessment of antigen-specific proliferation in peripheral chicken T cells by CFSE dilution, Veterinary immunology and immunopathology 138(1-2) (2010) 85-94.
[3] J. M. Aliotta, M. Pereira, E. H. Sears, et al., Lung-derived exosome uptake into and epigenetic modulation of marrow progenitor/stem and differentiated cells, Journal of extracellular vesicles 4 (2015) 26166.
[4] Patiwet Wuttisarnwattana, Saada Eid, David L. Wilson, et al., Assessment of the therapeutic role of mesenchymal stromal cells in a mouse model of graft-versus-host disease using cryo-imaging, Scientific reports 13(1) (2023) 1698.
[5] W. Liu, L. Li, X. Bai, et al., Osteosarcoma Cell-Derived Migrasomes Promote Macrophage M2 Polarization to Aggravate Osteosarcoma Proliferation and Metastasis, Advanced science (Weinheim, Baden-Wurttemberg, Germany) 12(17) (2025) e2409870.
[6] X. Ye, Y. Wu, H. Zhang, et al., Rapid generation of CD19 CAR-T cells by minicircle DNA enables anti-tumor activity and prevents fatal CAR-B leukemia, Cancer letters 568 (2023) 216278.
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