零基础操作Linux系统——Qiime2扩增子数据分析（入门级小白版）

原创已于 2024-11-13 21:50:42 修改 · 883 阅读

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于 2024-11-13 19:32:00 首次发布

数据准备。测序完成后得到md5.txt用于质量检测数据。以及R1forward，R2reverse双侧rawdata。上传至rawdata工作路径

编写两个文件，第一个无文件格式的sample；第二个是txt格式的new.txt。所有编写以“tab”键输入空格。上传至工作路径

1.第一列为样本名称。第二列为前端数据的绝对路径。第三列为后端数据的绝对路径

2.第一列为样本名称，应与1中的对应。中间输入三个“Tab”空格，然后第四列name为病人姓名。第五列site为样本的部位。第六列name-site为姓名＋部位组合

上传完成后下面开始正式的Linux系统操作。

一.进入工作路径，进入qiime环境

cd /share/lustre/fuyu/xjj/16s/rawdata

mamba activate qiime2-2023.5

二.检查文件的完整性

md5sum -c "/share/lustre/fuyu/xjj/16s/rawdata/338F_806R.raw_md5.txt"

三. 数据导入

qiime tools import --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' --input-path sample --output-path paired-demux.qza --input-format PairedEndFastqManifestPhred33V2

四. 去除引物

qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f CCTAYGGGRBGCASCAG --p-front-r GGACTACHVGGGTWTCTAAT --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza --verbose

若数据为单端数据，则将三四步骤替换为这段代码(单端为cleandata)

qiime tools import --type 'SampleData[SequencesWithQuality]' --input-path sample --output-path single-end-demux.qza --input-format SingleEndFastqManifestPhred33V2

五. 数据可视化

qiime demux summarize --i-data paired-end-demux.qza --o-visualization paired-end-demux.qzv

六.质量过滤

qiime dada2 denoise-single --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left 0 --p-trunc-len 0 --p-n-threads 20 --o-representative-sequences representative-sequences.qza  --o-table table.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza

七.将六的数据可视化

qiime feature-table summarize --i-table table.qza --o-visualization table.qzv

qiime metadata tabulate --m-input-file denoising-stats.qza --o-visualization denoising-stats.qzv

qiime feature-table tabulate-seqs --i-data representative-sequences.qza --o-visualization representative-sequences.qzv

八.绘制系统发育树

qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences representative-sequences.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza

九. 计算核心多样性。depth参数按照table.qzv中最小值输入。若最小值差距太大，则删除异常值重新选择最小值

qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table table.qza --p-sampling-depth 27164 --m-metadata-file new.txt --output-dir core-metrics-result

十.Alpha 稀释曲线

qiime diversity alpha-rarefaction --i-table table.qza --i-phylogeny rooted-tree.qza --p-max-depth 40993 --m-metadata-file new.txt --o-visualization alpha-rarefaction50000.qzv

十一.物种组成分析

qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier /share/lustre/fuyu/xxy/qiime2/database/gg_2022_10_backbone_full_length.nb.qza --i-reads representative-sequences.qza --o-classification taxonomy.qza

十二.用交互式条形图查看样本的分类组成

qiime taxa barplot --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file new.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv