qPCR 实验全攻略：AI 助你避开那些 “坑”

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qPCR（实时荧光定量 PCR）是一种极为重要的实验技术，它是一种在 DNA 扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，通过内参或者外参法对待测样品中的特定 DNA 序列进行定量分析。其操作流程包括实验前的精心准备、实验中的精准操作以及实验后的数据分析与解读等关键环节。

对于医学和生物学研究人员来说，qPCR 实验是探索基因奥秘的关键手段之一。然而，要想获得准确可靠的实验结果，实验操作过程中的每一个环节都不容忽视。接下来，就让我们详细了解一下 qPCR 实验操作的注意事项。

一、样本准备

样本采集与保存

样本采集要确保其具有代表性。例如，在采集组织样本时，要避免坏死或病变组织的污染。对于血液样本，应按照合适的抗凝方式处理，如使用 EDTA 抗凝管采集全血用于提取白细胞中的 DNA。

采集后的样本应尽快处理，如不能及时处理，要保存在合适的条件下。对于 RNA 样本，通常需要保存在液氮或 - 80℃冰箱中，以防止 RNA 降解。因为 RNA 酶广泛存在于环境中，且非常稳定，即使是少量的 RNA 酶也可能会降解 RNA。

核酸提取质量控制

提取核酸时，要严格按照试剂盒的说明书操作。例如，在使用酚 - 氯仿法提取 DNA 时，要注意有机相和水相的分层，避免吸取到中间的蛋白层，以免影响 DNA 的纯度。

提取后的核酸要进行质量检测。通过分光光度计检测核酸的浓度和纯度，A260/A280 比值可以反映核酸的纯度，对于 DNA，该比值在 1.8 - 2.0 之间较为理想，对于 RNA，比值在 2.0 - 2.2 之间较好。同时，还可以通过琼脂糖凝胶电泳来观察核酸的完整性，DNA 应呈现清晰的条带，没有拖尾现象。

二、引物设计与准备

引物设计原则

引物长度一般在 18 - 25bp 之间，过长或过短都可能影响扩增效率。例如，引物太短可能导致特异性降低，容易与非靶序列结合；引物太长则可能降低退火效率。

引物的 GC 含量要适中，一般在 40% - 60% 之间。GC 含量过高会使引物的解链温度过高，可能导致非特异性扩增；GC 含量过低则引物与模板的结合不稳定。

要避免引物自身形成二级结构，如发夹结构或引物二聚体。可以使用引物设计软件来检查和优化引物序列，如 Primer - Premier 等软件。

引物储存与稀释

引物合成后通常以干粉形式保存，要保存在 - 20℃以下的环境中，避免反复冻融。

稀释引物时，要使用无核酸酶的水或 TE 缓冲液，按照合适的浓度进行稀释。一般工作浓度在 0.1 - 1μM 之间，并且要准确记录稀释倍数，方便后续计算反应体系中引物的加入量。

三、反应体系配制

试剂添加顺序

在配制反应体系时，一般先加入水，然后加入缓冲液、dNTPs、引物、模板 DNA 或 RNA，最后加入酶。这样可以避免酶在不合适的环境中提前反应，因为酶对环境条件比较敏感，如温度、pH 等。

添加每种试剂时，要准确量取，使用经过校准的移液器，并且注意避免试剂之间的交叉污染。例如，在更换不同的试剂时，要更换枪头。

避免污染和误差

整个反应体系配制过程要在超净工作台或无菌环境中进行，防止外源 DNA 或 RNA 的污染。例如，要避免在有大量 DNA 或 RNA 样本的环境中配制反应体系，防止气溶胶污染。

要确保反应体系的体积准确，因为反应体系体积的微小变化可能会影响反应的效率和准确性。例如，在配制 20μL 的反应体系时，每种试剂的量都要精确加入，误差要控制在允许范围内。

四、PCR 反应过程

温度循环设置

根据引物和模板的特性，合理设置退火温度。退火温度一般比引物的熔解温度（Tm）低 3 - 5℃。可以通过梯度 PCR 等方法来优化退火温度，找到最佳的退火温度，以确保引物与模板的特异性结合，提高扩增效率。

延伸温度一般根据所使用的聚合酶来确定，Taq 酶的延伸温度通常为 72℃。延伸时间要根据扩增片段的长度来调整，一般每 1kb 的片段延伸时间约为 1 - 2 分钟。

防止反应过程干扰

在 PCR 反应过程中，要确保 PCR 仪的正常运行，避免仪器故障导致温度控制不准确或反应中断。例如，要定期对 PCR 仪进行维护和校准。

反应过程中不要频繁打开 PCR 仪的盖子，因为这样会导致温度波动，影响反应的准确性。同时，避免在 PCR 仪周围放置可能产生震动或电磁干扰的设备。

总之，qPCR 实验操作的每一个步骤都紧密相连，任何一个环节的疏忽都可能导致实验结果的偏差，要严格把控各个注意事项。

但在实际操作中要想让 qPCR 实验顺利进行并获得可靠的结果，其中可是有不少门道哦！今天就让我们借助行学AI 的力量，来详细了解一下 qPCR 实验可能遇到的问题吧。

一、当我们着手准备 qPCR 实验时，是不是感觉有很多琐碎但又至关重要的细节需要注意呢？别担心，我们可以向行学AI 这位 “智慧助手” 请教。首先，我们向 AI 提问：“qPCR 实验前需要准备哪些关键物品，以及如何确保这些物品符合实验要求？”

AI 回答：qPCR 实验前，需要准备高压过的枪头和 EP 管，这是为了避免外源 DNA 或 RNA 污染样本，从而影响实验结果的准确性。提 RNA 时要用无酶的 EP 管，因为 RNase 酶无处不在，无酶管能防止 RNA 被降解。移液枪要用酒精擦拭干净，减少交叉污染的风险。在配反应体系时，像 SYBR Green 等荧光染料需要避光操作，因为光照可能会导致其荧光特性发生改变，进而影响对 PCR 产物的定量检测。

二、在了解了实验前的准备要点后，实验中的操作过程同样不容小觑。每一个步骤都关乎着最终结果的可靠性。那在实际操作中，看会了并不代表能成功实验，又有哪些关键步骤和注意事项呢？让我们再次向行学 AI 寻求答案。我们接着问 AI：“在 qPCR 实验操作过程中，有哪些关键步骤和注意事项？”

AI 回答：在实验操作过程中，样本的处理要迅速且轻柔，避免反复冻融，防止核酸降解。加样时要确保准确性，尽量减少误差。PCR 反应的条件设置要根据所使用的酶、引物以及模板的特性进行优化，包括退火温度、延伸时间等。同时，要保证 PCR 仪的正常运行和校准，以确保每个循环的温度控制精准。

三、完成了实验操作，接下来就是面对实验结果了。这些看似复杂的数据背后，隐藏着我们所研究的基因信息。但如何才能从这些数据中准确地提取出有价值的内容呢？很多朋友，实验会做，但是分析一窍不通，这时候，还是得问问行学AI。我们继续向 AI 提问：“如何对 qPCR 实验得到的数据进行准确分析和合理解读？”

AI 回答：首先要检查扩增曲线的形状，正常的扩增曲线应该呈现典型的 “S” 型，且指数期明显。通过 Ct 值（循环阈值）来定量分析样本中的目标基因含量，Ct 值越小，说明起始模板量越高。同时，要进行熔解曲线分析，单一尖锐的熔解峰表明扩增产物的特异性高，如果出现多个峰，则可能存在引物二聚体或非特异性扩增。还可以通过与内参基因的 Ct 值比较，对目标基因进行相对定量分析，以校正样本间的差异。