关于RNA-Seq数据去接头(Adapter)这事需要讲一讲

本文详细介绍了RNA-Seq数据中接头、barcode的概念,以及使用cutadapt去除接头的过程和相关参数设置,强调理解原理的重要性,以避免处理数据时出现错误。

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关于RNA-Seq数据去接头(Adapter)这事需要讲一讲

首先来了解一下三个概念: 1、adapter是一段短的序列已知的核酸链,用于链接序列未知的目标测序片段。 2、barcode,也称为index,是一段很短的寡居核酸链,用于在多个样品混合测序时,标记不同的样品。 3、insert是用于测序的目标片段,因为是包括在两个adapter之间,所以被称为“插入”片段。

首先来了解一下三个概念:

1、adapter是一段短的序列已知的核酸链,用于链接序列未知的目标测序片段。

2、barcode,也称为index,是一段很短的寡居核酸链,用于在多个样品混合测序时,标记不同的样品。

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### RNA-seq 数据分析教程 #### 、概述 RNA-seq种用于研究基因表达谱的强大技术,能够提供高分辨率的转录本信息。通过测序和计算方法可以识别并量化不同条件下的转录产物变化情况[^1]。 #### 二、实验设计与样本准备 合理的实验设计方案对于获得可靠的结果至关重要。这包括选择合适的对照组和处理组样品数量、重复次数以及质量控制措施等。高质量的总RNA提取是成功实施RNA-seq的基础。 #### 三、读段预处理 原始下机数据通常含有低质量碱基、接头污染等问题,在进行下游分析之前需对其进行过滤清洗操作。常用的软件有Trimmomatic 或者Fastp来完成这过程: ```bash fastp -i input.fastq.gz -o output.fastq.gz \ --detect_adapter_for_pe \ --cut_right_mean_quality=20 \ --length_required=36 ``` #### 四、比对映射 将清理后的短序列片段(reads)回帖至参考基因组或转录本数据库中找到其对应的起源位置。针对不同的物种特性可以选择相应的策略——比如存在复杂剪切现象的人类或其他高等真核生物推荐采用支持剪切位点检测的方法;而对于缺乏内含子结构简单的微生物则可选用非剪接方式简化流程[^2]。 - **STAR**: 支持高效地处理大规模人类/哺乳动物全转录组范围内的拼接连接。 ```bash STAR --runThreadN 8 \ --genomeDir /path/to/genomeIndex \ --readFilesIn R1.fq.gz,R2.fq.gz \ --outFileNamePrefix ./aligned_ ``` - **Bowtie/Bowtie2**: 更适合于无内含子干扰的小型病毒或者细菌基因组上的快速定位任务。 #### 五、计数矩阵构建 基于上述所得BAM文件统计各特征区间内的唯匹配数目形成最终可用于差异表达检验的数据表单形式。FeatureCounts是个广泛应用的选择之: ```bash featureCounts -T 8 \ -a annotation.gtf \ -o counts.txt \ aligned_*.bam ``` #### 六、差异表达分析 利用专门开发出来的包如DESeq2, edgeR 来评估两组或多组间是否存在显著性的上调下调趋势,并校正多重比较带来的假阳性风险。同时内置了多种归化方案确保跨样本间的公平对比[^3]。 ```r library(DESeq2) dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = count_matrix, colData = sample_info, design = ~ condition) dds <- DESeq(dds) res <- results(dds) write.csv(as.data.frame(res), "differential_expression_results.csv") ``` #### 七、功能富集解析 最后步是对筛选出来的重要候选列表执行通路注解工作,揭示潜在机制关联性。常用工具有ClusterProfiler实现KEGG Pathway,Gene Ontology(GO) Terms 的批量查询绘制图形展示结果。 ```r library(clusterProfiler) ego <- enrichGO(gene = rownames(subset(res, padj<0.05)), OrgDb = org.Hs.eg.db, ont ="BP", pAdjustMethod = "BH") dotplot(ego) ```
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