数字微流控在医疗中的应用

10 数字微流控技术在医疗保健生物医学设备中的意义

10.1 引言

几十年来，微流控作为一门迅速发展的交叉学科，融合了软物质物理、生物化学和微系统工程，已成为学术界和工业界极为活跃的研究领域[1]。作为一种基于微尺度效应的流体处理技术，其核心理念是构建一种微器件，将多种功能（混合、分离、计量、检测等）集成于单一分析装置或芯片（即微全分析系统）中[2–4]。传统微流控芯片通常利用微通道、阀门和泵来控制流体流动。然而，这类芯片往往存在流体控制系统庞大以及“死体积”问题，导致处理和集成困难[5–7]。因此，对微液滴进行操控和控制的新方法已成为国际上微流控领域的研究热点[8–12]。

作为一种新兴且独特的液体操控技术，数字微流控（DMF）近年来引起了异常广泛的关注[13–15]。DMF最初被提出作为一种概念，旨在以类似于计算机的方式组织和操作复杂的微流控系统[16]。与在微通道中操控 µ升级液体的连续流微流控相比，数字微流控可对离散的皮升级至 µ升级二维微流控阵列中的液滴[17]。值得注意的是，基于液滴的微流控在微通道中处理两相或多相共存的情况，微液滴通常通过另一相流体进行传输[12,18]。相比之下，数字微流控在同一个平面上独立操控单个微液滴以执行不同功能。由于无需复杂的微通道网络、泵、微阀门或机械搅拌器，数字微流控相较于其他微流控系统具有诸多优势[17]。它集成了低试剂消耗、高通量、更少交叉污染、精确控制、简单制造和动态配置等优点[19,20]。因此，数字微流控已在环境监测[21,22], 药物安全[23], 化学分析[24], 和医疗保健[25,26]等领域展现出巨大潜力。

数字微流控提供了一个革命性的平台，其关键技术在于材料与表面特性、芯片微结构以及适当的驱动方法的结合。在数字微流控中操纵离散液滴的方法有很多[17], 例如介电层上的电润湿（EWOD）[16,27,28], 介电泳（DEP）[29], 光控电润湿[30], 表面声波[31], 以及磁控数字微流控[32]。其中，电润湿驱动设备最为流行，并且与数字范式密切相关。基于电润湿的数字微流控技术最早由费尔团队[33]在杜克大学和金昌珍团队[34]在加州大学洛杉矶分校于2000年提出。它利用静电和介电泳力，通过控制液滴在微电极阵列上接触角的变化，实现对离散液滴的精确控制[29]。施加一系列电势后，可按需从源端分配出单个离散液滴，并对其进行合并、分裂或在不同位置之间传输。此外，电润湿驱动设备与计算机技术兼容，具有高度可编程的应用潜力，因为微液滴的运动可通过数字信号直接控制电气开关[28,35]。

过去几十年见证了关于数字微流控生物医学设备的出版物激增，尤其是在医疗保健相关的许多过程和能力方面已经得到展示和发展。除了那两个开创性团队外，多伦多大学的惠勒团队[13,15]在临床分析[36], 生化检测[37], 以及细胞培养[38]方面也做出了重要贡献。本章旨在总结数字微流控的基本原理，并全面概述其在医疗保健用生物医学设备中的应用进展。

10.2 数字微流控技术

10.2.1 基础原理

现代电润湿基于电毛细作用，最早由李普曼于1875年描述[39]。图10.1展示了典型的电介质上电润湿配置，其结构包括电极层和疏水层，分别为未施加电压（图10.1A）和施加电压（图10.1B）的情况，其中在液滴与电极之间施加电压[40]。接触角随施加电压的变化由杨–李普曼方程[27], 调控，如公式(10.1–10.2)所示，其中γlg、γgs和γls分别表示液体–蒸气、固体–蒸气和固体–液体的表面张力。d为介电层厚度，ε0为真空介电常数，εr为其相对介电常数，V为施加电压；θ为施加电压V时的接触角，而θ0为未施加电压时的接触角[41]。

在图10.1A中，公式(10.1)是通过对作用在三相接触线上的力的水平分量进行平衡得到的[27,41]。当施加电压时，接触角受到影响，并在公式(10.2)[42]中表示出来。为了实现显著的接触角变化，通常需要疏水甚至超疏水层来增大θ0，如图10.1A所示。对于处于交流电场中的导电液滴，观察到从低频介电润湿向高频介电泳转变的现象[43]。

$$
\cos\theta_0 = \frac{\gamma_{gs} - \gamma_{ls}}{\gamma_{lg}} \quad (10.1)
$$

$$
\cos\theta = \cos\theta_0 + \frac{\varepsilon_0 \varepsilon_r}{2d\gamma_{lg}} V^2 \quad (10.2)
$$

10.2.2 驱动机制

在液滴上施加电场会产生界面张力的不平衡，从而驱动液滴的体相流动。各种驱动电路用于控制液滴在表面的形状和位置。这是基于电润湿的数字微流控设备的驱动机制，两种典型模型的数字微流控装置的截面如图10.2[44]所示。封闭式微流控设备是最常用的结构，由位于底板上的控制电极阵列与顶板上的参考电极之间形成的封闭腔室构成[45]。而在开放式微流控设备中，电气参考与控制电极位于同一基底上，从而可以将顶板从系统中去除，或将其用于除电控之外的其他功能。总体而言，通过施加一系列电脉冲，可以在电极阵列上实现液滴的移动、合并和分配，如图10.3[44]所示。

封闭式微流控设备被研究得最为广泛，主要是因为它可以轻松地生成和分裂液滴。然而，开放式微流控设备具有独特的优势，例如：（1）结构更简单，无需上层基底和其他支撑结构；（2）更高的混合效率[46], （3）能够移动更大的液滴；（4）更好的光学检测性能[47], 以及（5）与各种移液过程高度兼容，因为我们可以通过移液枪直接接触基底上的液滴。

10.2.3 器件制备与检测

液滴操控的实现基于电极的设计和疏水界面的制备。以封闭式数字微流控设备为例，底板上的电极阵列通常分为三个部分：储液电极、反应区电极和连接电极。储液电极具有较大面积，用于储存反应试剂；然后通过连接电极的逐步牵引形成微液滴。生成液滴的体积取决于末级电极的面积，液滴均匀性主要受电极的形状和数量影响。反应区电极是数字微流控装置的核心部分。所需功能越多，电极阵列结构越复杂。针对不同用途，反应区电极可采用多层结构，包括纳米探针、温度控制或三电极系统。

在研究电润湿时，疏水表面是液滴操控的关键因素之一。随着电场强度的增加，液滴在超疏水界面上的接触角逐渐变小。当电场减小时，液滴的接触角在特定循环内具有可逆性。具有高静态接触角的疏水材料将决定这种变化的程度，并决定液滴表面张力变化的强弱[45]。典型的疏水或超疏水界面材料列举如下[48]：（1）聚四氟乙烯AF1600 或 CYTOP、(2) 聚对二甲苯、(3) TiO2纳米颗粒、(4) 二氧化硅微球的梯度结构、(5) EGC 1700、(6) 粗糙氧化铝等。数字微流控装置的详细制备示意图如图10.4[49]所示。针对执行（贴壁）细胞检测，对电润湿驱动设备的疏水层进行可控生物功能化。该生物功能化技术包含一种干法剥离工艺，可简便地去除聚对二甲苯C掩模，并可在装置的聚四氟乙烯AF层中构建空间可控的生物分子微阵列。

大多数微流控平台上的检测通常依赖于光学检测[47]。沙姆西等人首次引入了基于电化学检测的数字微流控免疫分析[50], 如图10.5所示。在该系统中，基于氧化铟锡（ITO）的数字微流控顶板经过改造，集成了可用于在线安培测量的金感应电极和银对电极/伪参比电极。促甲状腺激素的检测限符合临床应用要求；此外，检测器结构简单、体积小，表明其在未来便携式分析中具有应用潜力。

10.3 数字微流控技术在医疗保健用生物医学器件中的应用

10.3.1 生物医学合成

数字微流控非常适合用于医疗保健领域的生物化学合成[51–54]。当查特吉等人提出该观点时，这一想法得到了进一步强化[55]首次展示了仅使用较低的电压（<100 V）和频率（<10kHz）即可在空气中操控有机溶剂、离子液体和水性表面活性剂溶液的液滴。任何液体的可操控性均可根据其频率相关的复介电常数进行经验预测。相关结果的应用已报道于液–液提取以及利用在水中溶解度有限的试剂进行的生化检测，以及芯片上的细胞裂解[56]。

在早期的化学应用演示中，米勒曼等人[57]展示了数字微流控可用于合成和操控具有先进结构的新类型颗粒（图10.6）。该方法利用电场，使自由悬浮的液滴和颗粒能够被捕获，并通过浸没在油中的电极阵列进行运输。每个悬浮在氟化液体中的微液滴作为微型反应器，通过载体液滴的固化形成。通过可控芯片上组装、干燥、封装和聚合，形成了各向异性“眼球”和聚合物胶囊、条纹颗粒以及半导体微珠。

杜波依斯等人[58]报道了在开放式电润湿系统中混合含有不同试剂的离子液体液滴，这是一种进行负载有机合成的有效方法（图10.7）。该技术应用于Grieco四氢喹啉的合成，通过在线和离线方式对最终产物进行分析，并与传统反应瓶的结果进行了比较。该技术为无需使用复杂、昂贵且笨重的机器人即可开展新合成提供了可能，并实现了在便携式设备中对化学过程的全面自动化。

杰布雷尔等人[59]提出了适用于并行控制多种多组分、多步骤反应的双板数字微流控平台用于化学合成（图10.8）。该系统实现了由三种不同组分同步合成肽大环化合物。所得产物包含氮丙啶，可作为通过亲核开环进行特异性后期修饰的位点。该研究展示了九元大环的合成，此类环尺寸通常与较大的合成困难相关。

采用相同方法进行传统环肽合成。新方法速度更快，易于自动化，兼容多种溶剂，特别适合并行处理。这些优势表明，数字微流控在化合物库的快速和自动化合成方面具有巨大潜力，可用于药物发现和高通量筛选等应用。

Keng 等人[60]开发了一种全电子式数字微流控装置，用于有机溶剂中的微尺度化学合成。该装置实现了[18F]‐氟代脱氧葡萄糖（[18F]FDG）的多步合成，F‐FDG 是正电子发射断层扫描（PET）中最常用的放射性示踪剂。此外，研究还表明，经纯化的 F‐FDG 批次可成功用于小鼠的 PET 成像，并通过了适用于人体使用的常规质量控制要求。该数字微流控装置对有机溶剂具有高度兼容性，能够对反应液滴进行复杂的操控和传感，并可在小体积下执行多种微尺度化学合成，包括含中间溶剂交换步骤的多步过程。

Witters 等人[61]首次证明可在数字微流控平台上打印出大量飞升级液滴阵列，并通过制备金属有机框架（MOFs）单晶阵列将该概念应用于材料合成（图10.9）。HKUST‐1[Cu3（BTC）2]晶体通过传输HKUST‐1前驱体母液滴进行打印。

溶液在数字微流控装置顶板上的氧化铟锡微片阵列（位于聚四氟乙烯AF背景基质中）。作者预计，该技术可为打印的MOF晶体进行简单易行的合成后修饰以赋予不同功能铺平道路。

Martin 等人[62]利用数字微流控、重组酶技术以及磁性纳米颗粒，创建了一种人工高尔基体细胞器的功能性原型（图10.10）。高尔基体细胞器被认为在血液凝固、感染和转移过程中发挥着关键作用。他们的研究结果获得了对抗凝血蛋白抗凝血酶III具有更高亲和力的硫酸乙酰肝素（HS），朝着构建仿生高尔基体装置迈出了关键一步。

10.3.2 分子诊断

作为一种多功能的新型离散微流控处理平台，数字微流控在分子诊断领域具有许多独特优势并得到广泛应用。分子样本的操作和表征是药物研究、医学诊断、基因治疗和法医学等多个领域的关键过程。这些过程通常在少量且珍贵的样本上进行，并以高度多重的方式完成，因此非常适合采用数字微流控技术。因此，数字微流控已广泛应用于脱氧核糖核酸的纯化和提取。

样本，通过连接生成重组DNA，脱氧核糖核酸杂交检测，聚合酶链式反应（PCR）和焦磷酸测序[14,16,20,52,54].

10.3.2.1 提取和纯化

在对DNA样本进行分析或表征之前，必须进行纯化和提取。Sista等人[63]采用注塑聚碳酸酯（PC）作为上板，PCB作为下板，利用集成盒式双板数字微流控芯片从基因损伤样本中提取人类基因组DNA。首先，将全血滴与含有细胞裂解液的液滴混合，然后引入含有DNA捕获磁珠的液滴以捕获细胞裂解液中的DNA。随后，在磁铁的辅助下分离磁珠，并反复用缓冲液洗涤以实现隔离和纯化。该集成数字微流控芯片具有自动进样、操作流畅和大反应面积的优点。数字微流控设备也被用于DNA转染反应。Madison等人[64]在数字微流控芯片的下板上集成了基于钛/金的电穿孔电极，并通过脉冲放电混合含有质粒DNA和大肠杆菌的液滴，如图10.11所示。通过电穿孔将质粒DNA转染至大肠杆菌中，实现了多次自动连续转染。

操作简单且响应迅速，可能在亚微米级基因工程的发展中起到决定性作用。

阿卜杜勒加瓦德等人[65]通过使用数字微流控技术实现液‐液萃取，从复杂混合物中纯化了脱氧核糖核酸样品。在该实验中，含有脱氧核糖核酸和蛋白质混合物的水相液滴被驱动进入并离开苯酚油池，从而去除液滴中的蛋白质并纯化核酸。提出了一种通过开发脱氧核糖核酸提取、回收、扩增和检测方法来检测肺炎支原体脱氧核糖核酸的实时聚合酶链式反应方案[66]。M. pneumoniae 特异性脱氧核糖核酸通过使用适当的生物素化捕获探针和链霉亲和素偶联磁珠从患者样本中分离出来。该微流控平台的灵敏度在测试范围内（100菌落形成单位/毫升）相当于传统的实时聚合酶链式反应。

10.3.2.2 样品采集与引入

在实际应用中，电润湿驱动设备要求输入的液体样品至少具有部分导电性，但对离子强度和pH值的变化相对不敏感。填充液和样品液的黏度显著影响液滴操作的速度。电润湿在处理高黏度或低表面张力液体时效果较差。此外，液体中的特定分子组分可能通过与设备表面的相互作用而恶化电润湿行为。例如，蛋白质可能在疏水表面上发生不可逆吸附，导致这些表面失去响应性[67]。此类“污染”的严重程度强烈依赖于具体的液体组分、填充液、涂层以及操作条件。然而，尽管存在这些限制，大多数常见的水溶液样品、试剂以及许多非水溶液样品已被证明可与电润湿数字微流控兼容。全血、血浆、血清和尿液等生理样本在特定条件下也具有兼容性[55]。虽然液体性质的变化可能影响单个液滴操作的速度，但通过使用适当的电路时钟，可在广泛的操作条件下保持这些操作的同步性。[68]尽管液体性质的变化可能影响单个液滴操作的速度，但通过使用适当的电路时钟，可在广泛的操作条件下保持这些操作的同步性。

10.3.2.3 聚合酶链式反应和DNA测序

聚合酶链式反应是一种用于体外扩增特定核酸序列的强大方法。它在诊断方面具有明显应用，可用于检测微量的病毒基因组。定量实时荧光定量PCR是一种用于核酸检测和定量分析的新方法。与常规PCR相比，实时荧光定量PCR能够实时监测DNA扩增进程，并可视化指数扩增阶段。这种实时监测是实现目标序列绝对定量的关键，通过连续测量扩增子积累过程中发射的荧光来实现[69]。

2010年华等人[70]开发了一种完全自动化的多通道数字微流控装置，用于基于集成盒式数字微流控芯片（图10.12A）的多通道实时荧光定量PCR实验，并实现了反应所需的温度控制和磁响应。

模块和荧光检测组件集成到系统中（图10.12A，左）。从体外磁珠中提取的耐甲氧西林Staphylococcus aureus基因组DNA被注入系统，并通过连续磁珠富集与PCR混合液混合。在PCR循环中实现了在两个热源之间的持续运动（图10.12A，右），从而可同时进行四次实时荧光定量PCR反应。该系统利用了数字微流控快速热传递和优异热稳定性的优势，检测到了相当于单个细胞基因组含量的样品量，并实现了高达94.7%的扩增效率。

数字微流控也已应用于基于焦磷酸测序的DNA测序[73]，这是一种边合成边测序方法。韦尔奇等人[74]利用简单的T形电极结构在数字微流控上验证了焦磷酸盐反应：将反应所需的样品、底物和酶分别放置在三个储液池中，然后从储液池中分配出含有单一类型核苷酸底物和酶的液滴，并将其移动至含有固定的单片段DNA样本的位置。随后，液滴经过一段时间的孵育，再通过CCD相机观察其化学发光信号。博尔斯等人[75]进一步集成了该系统，并在数字微流控上实现了焦磷酸测序，显著提高了测序长度、测序准确性和测序通量。

在蛋白质组学实验中，许多样本通常在通过质谱或其他检测器分析之前需要经过多次处理。数字微流控的阵列并行操控能力使其在蛋白质组学研究中得到广泛应用[76–78]。早期，数字微流控平台主要用于从复杂基质中纯化蛋白质或肽[79,80]。芯片结构为无表面修饰的双板模式，在其上进行多步磁珠富集、清洗和液滴混合操作。基本操作即可完成实验。梅等人[71]利用偶联了抗人血清白蛋白（HSA）、蛋白A和蛋白G的磁珠，在缓冲液中捕获人血浆蛋白，并通过简单的液滴混合和磁珠分离在数字微流控上实现了自动化蛋白质提取（图10.12B，I）。该八通道芯片采用独特的条形磁棱镜技术，可在10分钟内同时处理四个样本，IgG和HSA的提取效率均超过95%（图10.12B，II），可用于基质辅助激光解吸电离质谱（信噪比。

第10章 数字微流控技术在医疗保健用生物医学设备中的意义 295

MALDI‐MS的灵敏度几乎高出四倍。这种快速且自动化的提取方法
显著提高了样品处理的集成度和样品检测的灵敏度。王等人[72]
设计了一种核‐壳纳米颗粒Au@巯基苯甲酸（MBA）@Ag，其表面
包覆拉曼信号分子，实现了表面增强拉曼散射（SERS）信号放大功能，并可作为酶联免疫吸附测定（ELISA）中的信号输出（图 10.12C，IV）。H5N1流感病毒芯片实现了试剂和反应操作的自动化，减少了试剂用量，能够快速、灵敏且在线集成H5N1流感病毒检测，实现对复杂血清样本的直接且高灵敏度检测（图10.12C，I和 III）。

10.3.3 免疫分析

免疫分析是一种利用特异性抗体‐抗原相互作用来检测相关分析物的技术，广泛应用于临床诊断和生物化学分析。与传统免疫分析相比，数字微流控具有分析速度快、试剂用量少、易于集成和可编程自动化等优势。

Sista等人实现了针对人胰岛素和白细胞介素‐6的异源夹心免疫检测，并在每项检测中仅用7分钟就生成了标准曲线[63]。该工作进一步扩展到在全血样本中检测肌钙蛋白I，并取得了合理的准确性。彭等人[81]报道了一种有趣的手指驱动的数字微流控装置，该装置利用压电元件将手指产生的机械能转换为电脉冲以实现液滴移动，如图10.13A所示。含有“5‐溴‐4‐氯‐3‐吲哚磷酸/硝基蓝四唑”的液滴”有误，应为“5‐溴‐4‐氯‐3‐吲哚蓝四唑”，这是一种常用于碱性磷酸酶（ALP）的底物，在手指驱动下被输送至固定的抗体位点，并通过碱性磷酸酶标记抗体进行检测，如图10.13B所示。

阿尔方萨斯等人开发了一种带有便携式控制系统的低成本数字微流控设备，并用于对指尖采血的全血样本中麻疹病毒和风疹病毒特异性免疫球蛋白G（IgG）进行并行检测[82]。该数字微流控装置与执行酶联免疫吸附测定的集成仪器结合，可在实验室外用于远程检测。使用一种廉价的商用喷墨打印机打印导电材料

296 Chapter 10 数字微流控技术在生物医学设备中对医疗保健的重要性 e

将银墨水印刷到用作设备底板的柔性基板上，每个试剂盒均分配有唯一的批次/设备标识符，并将其编码在快速响应码中。涂覆有病毒抗原的超顺磁性颗粒从样本中捕获麻疹IgG或风疹IgG，随后进行化学发光检测处理。在将样本加载到试剂盒后，液体处理步骤将颗粒和液滴依次通过每个检测的九个连续步骤，最终将液滴移动至检测区，在此测量与结合的IgG相关的化学发光信号。结果显示，与在集中式实验室进行的参考检测相比，该IgG检测的灵敏度为86%（麻疹）和81%（风疹），特异性为80%（麻疹）和91%（风疹）。

最近提出了一种用于免疫分析的独立式、完全集成且自动化的数字微流控平台[83]。该系统展示了对四类化学和生物战模拟生物分子及生物体的自动化检测，如图10.14所示。人血清白蛋白（HSA）、枯草芽孢杆菌黑色变种（BG孢子）、MS2（一种噬菌体病毒）和大肠杆菌的检测分别实现了约30 ng/mL、4 × 10⁴ 菌落形成单位/毫升、10⁶ pfu/mL 和 2 × 10⁷ 菌落形成单位/毫升的检测限。这种完全集成的便携式平台在未来现场可部署的生物检测系统中展现出巨大潜力。

10.4 结论

总之，数字微流控技术代表了一种新兴工具，能够以类似于数字电路的方式精确控制液滴。数字微流控技术在生物医学设备中的应用凭借其高通量、易于集成、自动化、可寻址性、灵活的设备配置以及与其他技术多种结合的固有优势，在医疗保健领域发挥了重要作用，并取得了令人振奋的成果。最近，金氏团队[84]创新性地指出，所有基本的数字微流控流体操作均可通过在空气中使用掺杂硅片上的水来实现，仅需几伏的驱动电压和微安级电流。我们相信，数字微流控将吸引越来越多的关注，并将成为大多数生物医学设备中一项切实可行的技术。

然而，在将这些功能转化为用于医疗保健的实用设备之前，还需考虑各种挑战。例如，数字微流控设备能否与离心、高温和高压相兼容？通过引入反馈信号实现闭环集成，是否能使其变得更加智能化？在活细胞基因分型方面，如何在不破坏的情况下读取 DNA序列和信使RNA信息？重复使用后涂层疏水性的丧失是另一个关键挑战。这些问题

仍需解决。然而，未来预计不断扩大的研究者群体将继续推动数字微流控技术，以应对生物医学设备中的挑战。