人正常肺类器官实验指南

类器官（Organoids）技术近年来在生物医学研究领域大放异彩，尤其在个性化医疗、药物筛选和基础研究方面展现出巨大潜力。本文将以人正常肺类器官的培养为例，系统介绍其实验操作流程，包括原代培养、传代、冻存与复苏。

1. 原代培养：建立类器官的第一步

组织取材与处理

• 采集人正常肺组织，并在 2 - 8℃ 条件下快速转运至实验室。

• 在无菌环境下，使用 4℃ 预冷的原代培养缓冲液 B 进行清洗，去除杂质。

• 用手术刀或眼科剪去除粘膜，将组织剪切成 1~3 mm³ 组织块。

细胞分离与培养

• 组织块用 人正常肺原代组织消化液 C 进行消化，置于 37℃ 震荡 15-20 分钟，观察细胞状态。

• 当显微镜下观察到大量单个细胞或 70μm 以下的细胞簇 时，加入 3 倍体积缓冲液 B 终止消化。

• 通过 100μm 孔径筛网过滤，收集滤液后 300g 离心 5 分钟，弃去上清，重新重悬。

• 观察收集到的组织体积，按照 1:25 的比例添加基质胶重悬，并均匀铺板。

• 在 37℃ 培养箱中孵育 10-15 分钟 形成类器官基质，随后加入 人正常肺类器官培养基 A 进行培养。

2. 传代培养：扩增类器官

培养物收集与处理

• 吸去培养基，每孔加入 1-2ml 4℃ 预冷的类器官传代培养缓冲液 G，静置 2 分钟。

• 用移液枪轻柔吹打，收集基质胶悬液，4℃ 静置 10 分钟 进行进一步处理。

细胞处理策略

• 若类器官数量较少或体积较小，300g 离心 5 分钟，弃去上清，重悬于 1.5ml 离心管 中。

• 若类器官数量较多或体积较大，适量添加 类器官传代消化液 D，消化 2-3 分钟 后终止反应，再次离心收集。

• 添加基质胶重悬，并在 24 孔培养板 中铺板，每孔 25μl，孵育成胶后，加入 500μl 人正常肺类器官培养基 A 继续培养。

3. 冻存：长期保存类器官

冻存步骤

• 取出培养基，用 1-2ml 4℃ 类器官传代培养缓冲液 G 处理，收集类器官。

• 通过 离心 5 分钟 去除上清，随后加入适量 类器官冻存液 F，重悬细胞。

• 以 2 个孔类器官冻存 1 管 为标准，每管 1.4ml，做好标记。

• 采用 程序降温法 逐步降温，并将类器官储存于 液氮罐 中以长期保存。

4. 复苏：恢复冻存类器官

解冻与培养

• 在 37℃ 水浴锅 中快速融化冻存的类器官（1-2 分钟内 完成）。

• 用 300g 离心 5 分钟 去除上清，并重新悬浮于类器官传代培养缓冲液 G。

• 依照标准流程，铺板于 24 孔培养板，添加培养基 A 继续培养。

5. 类器官的应用前景

人正常肺类器官不仅在基础研究中具有重要价值，还可用于多种实验研究，如：

• 药物筛选：评估新药对肺组织的杀伤作用。

• 基因编辑：利用 shRNA 或 CRISPR/Cas9 技术进行功能研究。

• 荷瘤实验：研究肿瘤微环境对肺组织的影响。

• 多组学研究：DNA、RNA、蛋白质组、代谢组等。

• 单细胞测序：探索肺组织的细胞异质性。