Ag5IO6：高效抗生物膜银化合物

原创于 2025-10-18 00:35:12 发布 · 1.6k 阅读

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#Ag5IO6 # 抗生物膜 # 银化合物 # 医疗器械 # 抗菌

Ag5IO6：新型抗生物膜活性的一种银化合物及其在医疗器械中的应用

1. 引言

银（Ag）长期以来被认为具有抗菌特性[1]；然而，由于抗生素的广泛应用，以及银在接触氯离子−（形成低活性、难溶的氯化银）、蛋白质和其他体液成分[2]时容易失活，其在二十世纪的应用受到限制。此外，银化合物难以以适当的活性银物种释放速率整合到医疗器械中。近年来，已开发出多种新型银化合物/产品添加到医疗器械中，旨在克服这些障碍，主要作为抗生素替代品，以应对抗菌谱有限和微生物耐药性日益增长的问题。然而，这些银产品抗菌活性有限[3,4]，甚至对浮游微生物具有优异活性的产品，对生物膜的活性也有限[5]。细菌主要以生物膜形式存在[6]。生物膜导致了80%的人类感染[7]，通常比浮游微生物的耐药性高100–1000×倍[8]。因此，在测试新型银化合物的潜在临床相关性时，必须证明其对生物膜表型的疗效。

Ag5IO6被开发用于电化学电池[9]，但据我们所知，尚未被用作抗菌剂。Ag5IO6具有对抗生物膜的潜在疗效，同时也易于涂覆或掺入医疗器械，并具备适当的释放特性。这些特性包括银以阳离子（[Ag3]3+）和阴离子形式同时存在。它与高度氧化的碘形成配合物（[Ag2IO6]3−）[10]。这可能增强其相对于Ag+对生物膜的穿透能力，因为Ag+会结合到生物膜的负电荷表面。围绕阴离子银的高碘酸盐结构可能会减缓体液成分对其的失活作用。结合银和碘可能增加抗菌作用机制，降低对Ag5IO6产生耐药性的可能性。我们的合成方法结合了小晶粒尺寸与大颗粒尺寸，从而在大表面积上实现多晶性，这可能使其抗菌活性优于典型的银化合物[11]。Ag5IO6表现出优异的稳定性（储存、热、光、水、生理盐水、有机溶剂、高压灭菌、环氧乙烷等条件下），并且可以高纯度地轻松合成，易于沉积到金属上或掺入伤口敷料、凝胶、聚合物等中[12]。

本研究检测了Ag5IO6是否能够防止表面生物膜的形成并清除成熟生物膜，并将Ag5IO6与市售抗菌剂进行比较，以确定其活性是否具有新颖性。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 银5IO6

Ag5IO6的合成参照纳德沃尼等[12]的方法进行。通过X射线衍射检测产品纯度为100%。根据奥尔森等[14]的方法，将Ag5IO6涂覆于两种绷带上：一种是具有两层高密度聚乙烯外层和粘胶/聚酯芯的敷料（3ply‐Ag5IO6）；另一种是棉质弹性粘合绷带[13]（elastic‐Ag5IO6）。简而言之，将等量的敷料悬浮于1 L双蒸水（ddH2O）中，加入5 g Ag5IO6，在约360 转/分条件下搅拌2小时。敷料经空气干燥后密封保存待用。每种敷料的银含量通过将银从敷料上消解下来，并对消解液进行原子吸收光谱法三份[4]测定而确定。测得的银含量分别为1.42 ± 0.46 mg/cm²（3ply‐Ag5IO6）和1.52 ± 0.08 mg/cm²（elastic‐Ag5IO6）。敷料的X射线衍射结果显示，涂层工艺未影响银的组成。因此，任何活性上的显著差异均与材料附着性的不同有关。

2.1.2. 抗菌剂用于比较以下信息来自制造商的产品说明。

2.1.2.1. 银

纳米银（nanoAg） ：一种纳米晶银敷料，可在体外30分钟内杀灭细菌，作为抗菌屏障作用>3 天，对>150 种微生物[15]有效。未涂层对照组与3ply‐Ag5IO6基材相同。注意：进行抗黏附测试时，由于纳米银仅单面涂层，因此将敷料包裹在不锈钢片上，并在顶部粘合，使涂层面朝外。

“海藻酸银” ：一种含有海藻酸盐–CMC（羧甲基纤维素）的复合敷料，包含约5%（w/w）银–钠–氢–锆–磷酸盐，对多种微生物有效，使用时间长达7天。对照敷料与试验敷料相同，仅不含银[16]。

NaCMC‐Ag ：一种含银‐钠羧甲基纤维素（NaCMC）的Hydrofiber®敷料，含有1.2%（w/w）以氯化银[17]形式存在的银，可在体外对多种微生物提供长达7天的抗菌活性。对照组与试验敷料相同，但不含银[18]。

“氧银” ：一种含有多价银（0.4 mg/cm²）的银氧盐敷料，具有广谱作用，可持续7天[19]。对照组通过在测试前使用硫代乙醇酸钠/Tween/生理盐水[4]中和剂对氧银敷料进行中和处理制备。

2.1.2.2. 非银抗菌剂

PHMB ：一种浸渍了0.5%聚六亚甲基双胍（PHMB）的泡沫敷料，可在7天内对多种微生物有效。对照组为不含抗菌剂的相同泡沫敷料[20]。在成熟生物膜测试中，这些敷料打孔过厚，无法容纳所需溶液体积，因此被切成三等份，因此该敷料及其对照组的“1–3”个打孔分别代表1/3、2/3和1个敷料打孔。

“碘” ：一种带有纱布背衬的卡地姆碘膏（60% w/w，含0.9%碘），可提供广谱、快速（<10 分钟）的抗菌活性，持续72小时[21]。对照组为与敷料纱布背衬相匹配的纱布绷带。对于成熟生物膜测试，该敷料无法使用活检打孔器打孔，因此将敷料切成一至三个3 mm × 7 mm的片段。

“氯己定” ：浸渍于纱布中的含0.5%醋酸氯己定的白色软石蜡BP，可提供2–4天的广谱抗菌活性。对照为不含抗菌成分的石蜡纱布[22]。

2.1.3. 微生物

所用的微生物为铜绿假单胞菌 ATCC 27853、金黄色葡萄球菌 ATCC 6538（用于纳米银、羧甲基纤维素钠银、海藻酸银和银5IO6）、金黄色葡萄球菌 ATCC 29213（用于其余敷料）和白色念珠菌 ATCC 18804。

2.1.4. 测试用材料 for tests

除非另有说明，所有材料均购自 VWR （Radnor, PA）。0.9% NaCl用于预处理。挑战培养基中使用人血浆（人男性AB型血浆；SeraCare生命科学公司，马里兰州盖瑟斯堡）。抗黏附测试中的回收/中和缓冲液为STS [0，其成分为磷酸盐缓冲液] 中含1%（w/v）硫代甘油酸钠（费希尔科学公司，加拿大安大略省渥太华）和0.5%（w/v）吐温80；成熟生物膜测试中，针对纳米银、Ag5IO6、羧甲基纤维素钠银和海藻酸银，使用Difco Dey/Engley（DE）中和肉汤（贝克顿·迪金森公司，加拿大安大略省密西沙加）。对于浮游菌的对数减少试验，NaCMC‐Ag和alginate‐Ag使用STS作为中和剂，但STS在短时间内无法充分中和Ag5IO6，因此根据内部验证结果，采用添加了各5 g/L L‐半胱氨酸和谷胱甘肽的DE中和肉汤。该中和剂在后续所有商用敷料测试中均被使用。除非另有说明，平板培养和培养基分别使用胰蛋白胨大豆琼脂和肉汤。对于白色念珠菌，根据需要使用添加500 mM半乳糖的沙氏葡萄糖肉汤。

2.2. 方法

2.2.1. 抗黏附

2.2.1.1. 实验设置

将敷料/绷带片段切割成13 mm × 6 mm，并固定在24孔板的盖子上，每组实验设置三份。根据初步测试结果（数据未显示），预期对绷带构型差异所需的调整不会影响研究结果。对于无菌对照，未涂层的绷带经历所有溶液/步骤，但暴露于无菌培养基而非接种培养基（未观察到生长）。

2.2.1.2. 预处理

绷带浸泡于2 mL生理盐水中，并在洗脱开始后的第0天至微生物攻击天数（第1、7、14和28天）期间，在75 ± 15%湿度和35 ± 2°C条件下孵育，每周更换新鲜生理盐水三次。

2.2.1.3. 挑战

接种物通过将每种生物体从新鲜划线平板（按第2.2.2.1节进行的第二次次代培养）接种至50 mL肉汤中制备，并在35 ± 2°C下于旋转摇床（约150转/分钟，约12–18小时）[23]孵育。通过稀释10 000×（铜绿假单胞菌）、1000×（金黄色葡萄球菌）或100×（白色念珠菌）于含25%（体积比）人血浆的10%穆勒‐欣顿肉汤与0.9%生理盐水中，将接种物密度调整至约10⁵CFU（菌落形成单位）/mL[24]。通过对接种物进行连续稀释并点样涂布三份样本以确认接种物密度[23]。挑战步骤使用的接种物体积为2 mL。挑战后的平板置于旋转摇床（110转/分钟）上，在35 ± 2°C孵育24小时接触时间[23]。然后用2.5 mL生理盐水分别冲洗样品一次。

2.2.1.4. 浮游菌回收

孵育后，从每个孔中取出100 μL溶液，在生理盐水中梯度稀释（10⁰–10⁻⁷），并取10 μL点样涂布于平板上。平板在35 ± 2°C下孵育，约24小时[23]后计数菌落。数据以每段敷料的CFU数进行评估。

2.2.1.5. 附着微生物回收

将带有附着敷料的盖子放入中和剂中，超声处理40分钟，然后从每个孔中取出100 μL，进行梯度稀释（10⁰–10⁻⁷），并点样涂布（10 μL）。平板在35 ± 2°C下孵育，约24小时后计数菌落[23]。数据以每段敷料的CFU表示。

2.2.2. 成熟生物膜

2.2.2.1 生物膜生长

从保存在−70°C的冷冻保存菌种中，将每种生物体的首次继代培养物划线接种于琼脂平板上。在35 ± 2°C下孵育约24小时后，将平板用Parafilm®包裹并储存于4°C[23]。从首次继代培养物中进行第二次继代培养，处理方式与首次继代培养相同[23]，并在24小时内用于接种含50毫升培养基的微生物。随后在35 ± 2°C下，以旋转摇床（约150转/分钟）孵育12–18小时[23]。通过在培养基中稀释10 000×（铜绿假单胞菌）、1000×（金黄色葡萄球菌）和100×（白色念珠菌），将接种物浓度调整至约10⁵ CFU/mL。通过连续稀释和点样涂布三份样本[23]确认细胞密度。然后，将150 μL该接种物加入MBECTM P&G装置的相应孔中，并将带钉盖子置于含有微生物的底板上[23]。每个装置均放置于湿润培养箱内的轨道摇床上，在35 ± 2°C下孵育24小时（110转/分钟）[23]。通过将盖子浸入每孔含200 μL生理盐水的96孔板中1–2分钟[25]，以去除附着不牢的浮游细胞，从而清洗MBECTM装置上形成的生物膜。

2.2.2.2. 挑战

将测试和对照样品（6毫米直径的敷料打孔样本）平放入三个重复孔中，每种敷料使用1至3个打孔样本。使用多个打孔样本旨在测试条件下为非平衡型敷料生成浓度梯度。向每个孔中加入190 μL添加了25%（体积比）人血浆的培养基，以模拟感染伤口环境。向另外三份孔中加入190 μL无菌中和剂及三个6毫米直径的打孔样本，作为中和剂功能对照（补充表S1）。将带有附着生物膜的MBECTM盖子转移至这些挑战试验板中，并在35 ± 2°C下孵育24小时。

2.2.2.3. 浮游状态最小抑菌浓度（MIC）

挑战后，将每个挑战板孔中的溶液点样涂布（10 μL）至琼脂平板，于35 ± 2°C孵育约24小时，并观察生长情况。该最小抑菌浓度与挑战期间从生物膜脱落的细胞相关。最小抑菌浓度根据点样平板上的生长模式确定，其定义参照Harrison等人[25]，并以所需敷料打孔数量进行量化。

2.2.2.4. 浮游最小杀菌浓度（MBC）

挑战后，将每个挑战板孔中的20 μL溶液转移至含有180 μL每孔培养基的新鲜96孔板中。平板在35 ± 2°C下孵育24小时，并于[26]时观察生长情况。MBC的定义参照Harrison等人[25]，并量化为产生视觉清晰/非浑浊孔所需的敷料打孔数量。必要时，通过将每孔溶液点样涂布于琼脂（10 μL）并在35 ± 2°C下孵育24小时来确认数据。

2.2.2.5. 对数减少

将每个挑战平板的盖子取出，放入含200 μL生理盐水的96孔冲洗板中，每孔浸泡1–2分钟[25]。随后将盖子转移至含有200 μL中和剂/回收培养基的平板中，每孔超声处理30分钟以充分去除残留生物膜[23]。然后从每孔收集100 μL样品，进行梯度稀释(10⁰–10⁻⁷)，并取10 μL点种于琼脂平板上[23]。平板在35 ± 2°C孵育约24小时后计数[23]。数据以log₁₀每钉菌落形成单位（CFU/钉）表示。

2.2.2.6. 最小生物膜清除浓度（MBEC）

将培养基（100 μL）加入到回收/中和剂平板的每个孔中。平板随后在35 ± 2°C下孵育约24小时，并检测生长情况[23]。MBEC定义为杀死已形成生物膜所需的最低浓度，通过产生视觉清晰/非浑浊孔所需的敷料打孔数量进行量化。如有需要，数据将按照2.2.2.4节所述进行确认。

2.2.3. 浮游对数降低[3,4,27,28]

2.2.3.1. 样品制备

将三份敷料剪成2.54 cm × 2.54 cm，放置在塑料片（3.8 cm × 3.8 cm；Ziploc）上，并置于培养皿盖子的内侧。敷料用根据Cavanagh等人[4]确定的无菌ddH₂O润湿体积进行润湿。另取一些敷料用回收/中和介质润湿，作为中和剂对照。

2.2.3.2. 微生物生长

第一代和第二代继代培养以及培养基中的初始培养均按第2.2.2.1节进行。然后，取1 mL上述培养物接种至额外的烧瓶（100 mL）中，在35 ± 2°C下于旋转摇床（约150转/分钟）培养4–5小时，以获得处于对数期生长的微生物。通过连续稀释并采用点样涂布法在琼脂上对三份样本进行测定，确认接种物密度。

2.2.3.3. 挑战

将敷料（第2.2.3.1节）直接接种第2.2.3.2节中的300 μL接种物。在敷料上覆盖额外的塑料片（按第2.2.3.1节），以容纳接种物，并将培养皿底部垂直放置其上，确保细菌与敷料充分接触。随后将敷料在35 ± 2°C下孵育30分钟。将敷料和塑料片放入2.7 mL回收/中和介质中涡旋混匀。在生理盐水中进行连续稀释，并在琼脂上进行点样涂布（10 μL），然后将平板在35 ± 2°C下孵育，约24小时后计数。数据以每单位敷料表面积（cm²）的log₁₀ CFU表示。

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3. 结果

3.1. 抗黏附

只有含Ag5IO6的敷料（3ply‐Ag5IO6和elastic‐Ag5IO6）能够在所有测试菌种（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌）中实现防止微生物黏附，并在洗脱≥28天内消除周围的浮游微生物，达到对数减少>4的效果。其他市售敷料的表现如下：

铜绿假单胞菌 ：两种含银敷料（海藻酸银和NaCMC‐Ag）仅在洗脱28天后对该菌有效；PHMB、碘、氯己定和氧银在早期即失去活性。
金黄色葡萄球菌 ：Ag5IO6敷料在第1天即完全阻止黏附并消除浮游微生物；海藻酸银可阻止黏附但仅部分杀灭浮游菌；其余敷料均未能维持>4对数减少。
白色念珠菌 ：Ag5IO6敷料在整个28天测试期内均有效；NaCMC‐Ag和3ply‐Ag5IO6在第1天完全阻止黏附；PHMB仅在后期表现出一定活性。

当某种敷料在某一时间点对浮游微生物和黏附生物量均达到<4对数减少时，该敷料被移出研究（标记为“N”）。

3.2. 成熟生物膜

含Ag5IO6的敷料能够对所有测试的生物膜实现>4对数减少。具体结果如下：

铜绿假单胞菌 ：3ply‐Ag5IO6在2–3个打孔时产生>4对数减少（P < 0.001），elastic‐Ag5IO6和碘在所有测试“浓度”下均产生>4对数减少。PHMB、海藻酸银、NaCMC‐Ag、纳米银、氯己定和氧银均无效或效果微弱。
金黄色葡萄球菌 ：两种Ag5IO6敷料、PHMB和碘在所有“浓度”下均显示出>4对数减少。其余敷料（包括所有其他银制剂）活性极低或无活性。
白色念珠菌 ：3ply‐Ag5IO6在1–2个打孔时产生>4对数减少；elastic‐Ag5IO6在1–2个打孔时也有效；碘在2次穿孔时活性优于1次和3次（P < 0.05和P < 0.001）。其他所有市售敷料均无显著活性。

根据综合统计分析，破坏/杀灭成熟生物膜的效果排序为：
Ag5IO6：elastic‐Ag5IO6 (158×) > 3ply‐Ag5IO6 (122×) > 碘 (102×) > PHMB (24×) > NaCMC‐Ag (19×) > alginate‐Ag (8×) > nanoAg (2×) > 氯己定 (1×) > 氧银 (0×) 。

唯一能对多种生物膜产生>4对数减少的市售敷料是：
- 碘：对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌有效；
- PHMB：仅对金黄色葡萄球菌有效。

3.3. 浮游对数减少

在标准30分钟浮游生物对数减少试验中：
- Ag5IO6敷料 （3ply‐Ag5IO6和elastic‐Ag5IO6）对所有三种微生物均实现了完全杀灭（>4对数减少），表现为彻底无菌生长。
- 海藻酸银和NaCMC‐Ag 不仅未实现完全杀灭，反而表现出负对数减少（即促进微生物生长的趋势），数据分别为：
- 海藻酸银：P. aeruginosa (-0.21), S. aureus (-0.35), C. albicans (+0.48)
- NaCMC‐Ag：P. aeruginosa (-0.13), S. aureus (-0.51), C. albicans (-0.64)

相比之下，Ag5IO6敷料的对数减少值极高：
- 3ply‐Ag5IO6：P. aeruginosa (7.63), S. aureus (8.24), C. albicans (5.68)
- elastic‐Ag5IO6：P. aeruginosa (7.60), S. aureus (7.88), C. albicans (5.49)

这些结果明显优于文献报道的其他含银敷料（见表4）。

示意图6
示意图7
示意图8

表格数据摘要

表1. 针对铜绿假单胞菌成熟生物膜的MIC、MBC和MBEC

敷料	MIC	MBC	MBEC
3ply‐Ag5IO6	≤1	≤1	>3
elastic‐Ag5IO6	≤1	≤1	>3
碘	1	1–3	2
PHMB	3	3	>3

表2. 针对金黄色葡萄球菌成熟生物膜的MIC、MBC和MBEC

敷料	MIC	MBC	MBEC
3ply‐Ag5IO6	≤1	≤1	>3
elastic‐Ag5IO6	≤1	≤1	2
PHMB	≤1	≤1	2
碘	≤1	≤1	1

表3. 针对白色念珠菌成熟生物膜的MIC、MBC和MBEC

敷料	MIC	MBC	MBEC
3ply‐Ag5IO6	≤1	≤1	≤1
elastic‐Ag5IO6	≤1	>3	≤1
PHMB	≤1	≤1	>3

表4. 浮游微生物对数减少值比较（本研究 vs 文献）

敷料	P. aeruginosa	S. aureus	C. albicans
3ply‐Ag5IO6 (本研究)	7.63	8.24	5.68
elastic‐Ag5IO6 (本研究)	7.60	7.88	5.49
Acticoat™ (纳米银)	4.7	4.0	4.7
Kerlix™ AMD (PHMB)	5.0	3.3	4.8
海藻酸银 (本研究)	-0.21	-0.35	0.48
NaCMC‐Ag (本研究)	-0.13	-0.51	-0.64

4. 讨论

Ag5IO6展现出独特的广谱抗生物膜活性，具备三大核心优势：
1. 长期防止微生物黏附 ：在≥28天的洗脱周期内持续有效，防止铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的黏附；
2. 快速杀灭浮游微生物 ：在30分钟内实现对所有测试菌种的完全杀灭（>4对数减少）；
3. 高效破坏成熟生物膜 ：对三种病原体的成熟生物膜均能实现>4对数减少，显著优于绝大多数市售抗菌敷料。

其卓越性能可能源于其独特的化学结构：
- 银以阳离子（[Ag₃]³⁺）和阴离子（[Ag₂IO₆]³⁻）形式共存，增强了穿透生物膜负电荷表面的能力；
- 高碘酸盐结构保护银离子免受体液成分（如氯离子、蛋白质）的失活；
- 银与碘协同作用，增加了抗菌机制多样性，降低了耐药风险；
- 多晶性小颗粒结构提供了更大的反应表面积。

相比之下，多数市售敷料存在明显局限：
- 纳米银 ：虽具良好浮游杀菌动力学，但释放快、有效期短，且易因生理盐水预浸泡失活；
- 海藻酸银与NaCMC‐Ag ：对浮游菌无效甚至促进生长，抗生物膜能力极弱；
- PHMB与碘 ：具有一定活性但呈物种特异性，且作用时间有限；
- 氯己定与氧银 ：整体表现最差，几乎无抗生物膜活性。

本研究所用方法（抗黏附试验、MBEC™模型、浮游对数减少试验）已被证实与体内模型具有良好相关性，表明Ag5IO6的体外优势有望转化为临床效益。