细胞传代操作全指南：把握时机，杜绝污染，附核心原理与实操细节

在细胞培养过程中，传代是维持细胞活性与增殖的核心环节。一步操作失误，轻则导致细胞活性下降，重则引发污染或细胞死亡。本文结合实操经验，详细拆解细胞传代的关键原理、操作步骤及注意事项，帮助科研人员稳定掌握传代技巧，减少实验失误。

一、细胞贴壁与胰酶作用的核心原理

传代操作的前提是理解细胞的生长特性与消化机制，尤其是贴壁细胞（如 HeLa、CHO 细胞）的传代，需重点掌握以下原理：

1. 贴壁细胞的生长特性

贴壁细胞多来源于实体器官，其生长依赖 “附着点”：

• 细胞会分泌细胞外基质（如胶原蛋白、纤维连接蛋白），形成自身生长的 “支架”；
• 通过细胞膜上的黏附分子（如整合素）与基质结合，同时细胞间通过黏附分子相互连接，最终呈现 “铺路石状” 或 “纤维状” 单层生长。
• 若无法稳定贴壁，细胞会因缺乏支撑而死亡，因此贴壁稳定性是此类细胞存活的基础。

2. 胰酶的消化机制

贴壁细胞的 “固定” 依赖两种连接：一是细胞与瓶底细胞外基质的结合，二是细胞间的相互黏连。胰酶作为一种蛋白酶，其核心作用是：

• 特异性切断上述连接中蛋白质的肽键，破坏细胞与基质、细胞与细胞间的黏附；
• 使细胞从瓶底脱离，同时打散细胞团，形成单细胞悬液，为后续均匀传代奠定基础。

注意：胰酶的作用具有特异性，但其活性会被血清抑制，这也是后续用含血清培养基终止消化的原理。

3. 消化状态的判断标准

消化是传代的关键步骤，“恰到好处” 的消化直接影响细胞活性：

• 消化不足：细胞仍紧密贴附于瓶底，形态完整，晃动培养瓶无明显脱落；
• 消化适中：镜下可见细胞逐渐变圆、回缩，细胞间隙增大，轻晃培养瓶时部分细胞随液体漂浮；
• 过度消化：细胞变圆后出现皱缩、破裂，瓶底可见细胞碎片，此时细胞活性已受损，后续难以培养。

实操技巧：消化过程中需频繁镜检（建议每 30 秒至 1 分钟观察一次），优先选择 “稍欠消化”（可补加胰酶二次处理），避免过度消化。

二、细胞传代的关键时机与操作步骤

传代的核心是 “时机把控” 与 “无菌操作”，以下为标准化步骤及注意事项：

1. 传代时机的判断

• 细胞密度：当细胞汇合度达到 80%-90% 时为最佳传代时机。汇合度过低（<70%）会导致传代后增殖缓慢；过高（>90%）则易引发细胞老化、形态异常。
• 污染排查：操作前需观察培养基状态 —— 清澈透明、细胞形态正常（无异常黑点、颗粒或浑浊）方可进行；若存在污染，需立即丢弃，避免交叉感染。

2. 具体操作步骤

（1）洗去残留血清

• 倒掉旧培养基，沿培养瓶壁缓慢加入 PBS（10cm 培养皿通常加 2mL，小规格培养瓶按比例调整），避免直接冲击细胞（防止损伤贴壁细胞）。
• 轻晃培养瓶，使 PBS 覆盖所有细胞，目的是洗去残留血清（血清会抑制胰酶活性）及死细胞，随后倒掉 PBS。

（2）胰酶消化处理

• 加入适量胰酶（10cm 培养皿加 2mL，按容器规格调整），缓慢转动培养瓶，确保胰酶均匀覆盖细胞表面，置于培养箱中静置消化（具体时间根据细胞类型调整，需结合镜检判断）。

（3）终止消化与细胞悬液制备

• 当镜下观察到细胞变圆、间隙增大，轻晃瓶体有部分细胞脱落时，立即加入等量含血清的培养基（血清可中和胰酶，终止消化）。
• 用移液枪沿瓶壁边缘向中间轻轻吹打，使未脱落的细胞完全脱离瓶底，制成单细胞悬液（吹打时避免用力过猛，防止产生气泡损伤细胞）。

（4）离心收集细胞

• 将细胞悬液转移至无菌离心管，1000rpm 离心 5 分钟（离心参数可根据细胞类型微调）。
• 离心后倒掉上清液（含胰酶及代谢废物），管底可见细胞沉淀。

（5）重悬与接种

• 根据传代比例（如 1:4 传代）加入新鲜培养基（1:4 传代可加 4mL），轻轻吹打细胞沉淀，使细胞均匀分散。
• 将细胞悬液接种至新培养瓶，轻晃瓶体（可画 “8” 字或 “米” 字轨迹），使细胞均匀铺展于瓶底，随后放入培养箱培养。

三、细胞传代后恢复观察要点

传代后需密切关注细胞状态：

• 接种后 4-6 小时，贴壁细胞开始重新贴附瓶底（不同细胞类型时间有差异）；
• 24 小时后观察细胞形态是否恢复正常（如铺展状态、密度均匀性）；
• 若出现大量漂浮细胞或形态异常，需排查消化是否过度、接种密度是否合适或培养基是否污染。

结语

细胞传代看似步骤繁琐，实则是熟能生巧的过程。核心在于 “多观察、少失误”—— 通过反复实操积累对细胞状态的判断经验，才能稳定维持细胞活性。本文整理的原理与步骤适用于多数贴壁细胞传代，具体操作时需结合所用细胞类型的特性灵活调整。

希望本文能为科研人员提供实用参考。