鼠单抗杂交瘤制备全攻略：提高效价的核心策略与技术优化

 

掌握关键技术点，轻松获得高效价单克隆抗体

鼠单克隆抗体作为生物医药研究与诊断试剂开发的核心工具，其制备效率与质量直接影响实验进度与成果。本文将深入解析鼠单抗杂交瘤制备全流程，并重点分享提高效价的关键策略与技术优化方案。

一、传统杂交瘤技术制备流程

鼠单抗制备基于 Köhler 和 Milstein 于 1975 年创立的杂交瘤技术，核心是将免疫小鼠的脾细胞（B 细胞）与骨髓瘤细胞融合，形成既能无限增殖又能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。主要流程如下：

1. 免疫动物

动物选择：6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠（免疫应答稳定且与常用骨髓瘤细胞同源）

抗原准备：蛋白抗原推荐剂量 40-50μg/次，与佐剂充分乳化（乳化成功标准：滴入水面不迅速扩散）

免疫程序（以蛋白抗原为例）：

初次免疫：弗氏完全佐剂 + 抗原，皮下多点注射

二次加强（第 14 天）：弗氏不完全佐剂 + 抗原，皮下注射

三次加强（第 28 天）：弗氏不完全佐剂 + 抗原，腹腔注射

四次加强（第 42 天）：无佐剂抗原，静脉注射

效价检测：采用间接 ELISA 法检测血清抗体效价，通常免疫后 10-14 天达到峰值

2. 细胞融合

脾细胞制备：冲击免疫 3 天后摘取脾脏，研磨过滤制备单细胞悬液

骨髓瘤细胞准备：选择处于对数生长期的 SP2/0 或 NS-1 细胞（需提前验证 HGPRT 酶缺陷）

融合方法：

PEG 融合：传统方法，混合脾细胞与骨髓瘤细胞（比例 1：3），加入 50% PEG1450 作为融合剂

电融合：现代高效方法，通过电场作用提高融合效率（比 PEG 法高 1.5-3 倍）

3. 选择性培养与筛选

HAT 培养基筛选：

氨基蝶呤（A）阻断 DNA 主要合成途径

未融合骨髓瘤细胞（缺乏 HGPRT 酶）死亡

未融合脾细胞（无法体外长期增殖）自然死亡

杂交瘤细胞通过补救途径（利用 H 和 T）存活增殖

阳性克隆筛选：采用 ELISA、流式细胞术或免疫荧光法检测上清液特异性抗体

克隆化：有限稀释法（主流）或流式分选单细胞，确保单克隆性

4. 单克隆抗体生产

体内诱生法：预处理小鼠腹腔注射降植烷，接种杂交瘤细胞 1-2 周后抽取腹水（抗体浓度高）

体外培养法：生物反应器悬浮培养（适合无动物成分需求），新型微载体/中空纤维技术显著提高产量

二、提高效价与效率的核心策略

1. 免疫方案优化

佐剂升级：采用新型强效佐剂（如 PAP-1 纳米佐剂），提高血清效价 50-100 倍，使血清稀释 12.8 万倍时 OD 值仍 >2.0

免疫途径优化：淋巴结内免疫可显著增加抗原特异性 B 细胞比例

冲击免疫：融合前 3 天进行无佐剂抗原静脉注射，激活生发中心 B 细胞

2. B 细胞富集技术

传统融合效率低（仅 0.2-5% 杂交瘤分泌目标抗体），主要因脾脏中：

40-60% 为 IgM⁺ 幼稚 B 细胞

40-60% 为非 B 细胞（T 细胞、髓系细胞等）

富集策略：

负向分选：联合抗 IgM 磁珠 + Pan-B 磁珠试剂盒（含抗 CD3/CD4/CD8/CD11b 等），去除 IgM⁺ 细胞与非 B 细胞，富集 IgG⁺ 记忆 B 细胞

效果：特异性杂交瘤比例提高 2-17 倍，阳性克隆占比从 <5% 提升至 30-50%

3. 融合技术创新

电融合优化：

预刺激：CpG 寡核苷酸刺激 16 小时，使 B 细胞直径从 7μm 增大至 12μm，匹配骨髓瘤细胞大小，提高电融合效率 2.5 倍

参数调整：根据细胞大小优化电压（B 细胞小需更高电压）

微平行杂交瘤(MPH)技术：阵列化单细胞配对融合，提高通量与成功率

4. 高通量筛选方案

流式分选技术：抗原荧光标记后，通过流式细胞仪直接分选阳性杂交瘤至 384 孔板，避免繁琐亚克隆

优势：

筛选通量提高 2-3 个数量级

时间缩短 50%

单次融合可获得 100-500 株强阳性抗体

三、关键实验技巧与避坑指南

抗原乳化验证：取一滴乳化抗原滴于水面，不扩散即合格，过度乳化反而不利于抗原释放

融合细胞活性保障：

全程操作在 37℃ 环境下快速完成

使用预温培养基稀释 PEG（避免温度休克）

克隆化时机：初次筛选阳性后立即进行，避免优势克隆过度竞争

支原体污染防控：定期检测，融合前对骨髓瘤细胞进行支原体清除处理

四、总结

现代鼠单抗制备已从传统经验操作转向精准高效的技术体系，核心策略包括：

1 通过新型佐剂与冲击免疫提高抗体多样性

2 采用B细胞富集结合电融合提升有效杂交瘤比例

3 利用流式分选技术实现高通量筛选

这些技术不仅提高效价，更为治疗性抗体的人源化改造奠定基础，推动抗体药物研发进入新阶段。

技术参考：文中优化方案部分源自专利 WO2014093786 及 StemCell Technologies 的 RoboSep 系统验证数据。