氨基酸修饰PEI提升基因递送效率

具有增强的基因递送效率和生物相容性的氨基酸修饰聚乙烯亚胺

摘要

开发高效且具有高生物相容性的基因递送载体是基因治疗的关键之一。一系列聚阳离子由聚乙烯亚胺（PEI）与多种氨基酸或其类似物制备而成。这些目标聚合物具有不同的电荷和亲水/疏水平衡性质，可能影响其在基因转染过程中的表现。凝胶阻滞和动态光散射分析表明，这些聚合物可将脱氧核糖核酸压缩成具有正泽塔电位和适合细胞摄取尺寸的纳米颗粒。荧光素酶报告基因转染结果表明，它们的转染效率高于PEI；尤其是在血清存在下，采用接枝乙醇酸的聚乙烯亚胺可实现高达23倍的更高效率。此外，研究发现PEI上的取代度对转染有明显影响，正/负电子基团之间的平衡在很大程度上影响递送过程。更高的血清耐受性也通过牛血清白蛋白吸附、流式细胞术和共聚焦显微镜分析得到证实。结果表明，此类聚阳离子可作为有前景的非病毒基因递送载体。

关键词

基因递送；聚乙烯亚胺；非病毒基因载体；生物相容性

1. 引言

作为一类重要的非病毒基因递送载体，阳离子聚合物因其良好的稳定性、易于制备和修饰而受到关注[1,2]。阳离子聚合物可通过静电相互作用高效压缩脱氧核糖核酸，其阳离子特性还可能促进聚合物/DNA复合物（多聚体）与带负电荷的细胞膜之间的接触，从而实现更好的细胞摄取。用于基因递送的主要聚合物材料包括聚乙烯亚胺（PEI）[3,4],聚(L‐赖氨酸)[5],聚（叔胺甲基丙烯酸酯）[3],和聚酰胺胺[6],等。在这些聚合物中，聚乙烯亚胺因易于获得而被广泛研究。高分子量聚乙烯亚胺（HMW PEI），特别是分子量为25千道尔顿的聚乙烯亚胺，具有相对较高的转染效率。

聚合物2015，7，2316–2331；doi:10.3390/polym7111516 www.mdpi.com/journal/polymers

转染效率（TE）在体外和体内均表现出色。这使其成为新型聚合物载体设计的金标准[7–9]。然而，高分子量PEI介导的基因递送伴随着较高的转染效率，同时也存在显著的细胞毒性和有限的生物相容性[10,11]。因此，开发兼具高转染效率和改善生物相容性的新型PEI基材料具有重要意义。

近年来，人们已付出大量努力以克服PEI[12–17]的缺点。Wang等研究表明，在PEI上引入疏水十二烷链可通过增强脱氧核糖核酸从易体向细胞质的逃逸来提高转染效率，但遗憾的是，其生物相容性并未得到有效改善[12]。拉明哉及合作者发现，保持一级胺数量不变的聚乙烯亚胺烷基少肿胺衍生物是一种有效策略，可在维持低毒性的同时平衡疏水‐亲水性能并提升转染效率[13]。卓发现，引入富含羟基的“皮肤”结构可使接枝型聚合物PEI‐g‐5‐乙基‐5‐(羟甲基)‐1,3‐二氧六环‐2‐酮（PEI‐g‐EHDO）具有显著改善的生物相容性，并对血清相关有害效应（如蛋白质吸附、粒子聚集和多阳离子‐蛋白质交换）表现出更强的抗性[11]。此外，聚乙二醇（PEG）已被证明能够屏蔽复合物表面的正电荷，从而提高血清耐受性[14–16]。然而，此类聚合物涂层带来的强烈电荷屏蔽和体积排除效应会干扰多阳离子/DNA复合，并阻碍其高效进入细胞的内化作用[17]。鉴于上述问题，旨在实现更高转染效率同时改善生物相容性的PEI修饰并非易事。疏水与亲水性能之间以及DNA结合与释放能力之间的平衡至关重要。

借鉴这些研究的启示，本研究旨在将疏水、侵水或带电元素引入聚合物结构中，并评估它们对转染效率、细胞毒性和血清抗性的影响。为此，我们选择丝氨酸（Ser）、乙醇酸（Ga）、甘氨酸（Gly），N，N‐双(21‐氨乙基)甘氨酸（Deta）和亮氨酸（Leu）对25 kDa PEI进行修饰，得到不同取代度（DS）的衍生物。在这些新型聚合物中，与PEI相比，Ser‐PEI引入了侵水性羟基团且不减少胺基数；Ga‐PEI用羟基替代部分胺基；Gly‐PEI保持胺基数不变；Deta‐PEI可能增加一级胺基团的数量；而Leu‐PEI则引入疏水烷基团。以HEK293、HeLa和U‐2OS细胞为模型的实验表明，这些修饰聚合物表现出更好的生物相容性、血清抗性和转染效率。

2. 实验部分

2.1. 材料

除非另有说明，所有化学品和试剂均为市售产品，未经进一步纯化直接使用。无水氯仿（CHCl₃）和二氯甲烷（CH₂Cl₂）经氢化钙（CaH₂）干燥后蒸馏处理。柱层析采用200–300目硅胶或200–300目Al₂O₃。所有水溶液均使用去离子水或蒸馏水配制。

¹H NMR谱图在Bruker AM400核磁共振波谱仪（瑞士苏黎世）上测定。核磁共振谱图的质子化学位移以ppm表示，内标TMS为参考（¹H，0.00 ppm）。N‐(tert‐丁氧羰基)‐L‐丝氨酸、N‐(tert‐丁氧羰基)‐L‐甘氨酸和N‐(tert‐丁氧羰基)‐L‐亮氨酸购自阿拉丁工业公司（中国上海），MicroBCA蛋白检测试剂盒购自Pierce（美国伊利诺伊州罗克福德），荧光素酶检测试剂盒购自普洛麦格（美国威斯康星州麦迪逊），无内毒素质粒纯化试剂盒购自天根（中国北京），细胞计数试剂盒‐8（CCK‐8）购自同仁化学研究所（日本熊本）。本研究使用的质粒为编码荧光素酶DNA的pGL‐3（普洛麦格，美国威斯康星州麦迪逊）和编码EGFP DNA的pEGFP‐N1（Clontech，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）。杜氏改良鹰类培养基（DMEM）和胎牛血清购自英潍捷基公司（中国成都）。Cy5TM购自Molecular Probes（Mirus, 美国威斯康星州麦迪逊）。HEK293T人胚胎肾细胞系、HeLa细胞系和U‐2OS人骨肉瘤癌细胞购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所（中国上海）。氮原子1,氮原子”‐二‐Boc‐氮原子,氮原子‐双(21‐氨基乙基)甘氨酸的合成方法如先前报道[18]。

2.2. 聚合物的制备

在冰浴中，将N‐(叔丁氧羰基)羧酸（2 mmol）、EDCI（2.4 mmol）、HOBT（2.4 mmol）和DIEA（2.4 mmol）溶于50 mL干燥的二氯甲烷中搅拌0.5小时。然后，根据摩尔比加入相应量的PEI（25 kDa），并溶于干燥的二氯甲烷后加入反应体系，室温下继续搅拌反应两天。反应完成后，加入甲醇/HCl溶液以脱除保护基团叔丁氧羰基（Boc）。将残留物溶于少量水中，并在去离子水中透析（截留分子量8000–14,000 kDa）三天。经冷冻干燥后得到白色或淡黄色固体产物。产率：46%–62%。

2.3. 聚合物表征

¹H NMR谱在Bruker AV 400‐MHz仪器上于25 °C条件下，在D₂O中测得。所制备的阳离子聚合物的分子量（Mw）和多分散性（PDI，Mw/Mn）通过凝胶渗透色谱（GPC）系统测定，该系统包括Waters 515泵、Linear 7.8 mm × 300 mm色谱柱（Waters Corp, Milford, MA, USA）、18角激光散射仪（Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA, USA）以及OPTILAB DSP干涉式折光仪（Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA, USA）。以经过0.02 µm滤膜过滤的NaAc（0.3 M，pH 4.4）作为洗脱液，流速为0.5 mL/min。

Ser‐PEI：¹H NMR (400 MHz, D₂O, TMS)：δ = 2.64–3.50 ppm (m, PEI–H 和 –CH(NH₂)CH₂OH)，3.76 ppm (s, –CH₂OH)。
Ga‐PEI：¹H NMR (400 MHz, D₂O, TMS)：δ = 2.52–3.25 ppm (m, PEI–H)，3.94 ppm (s, –CH₂OH)。
Gly‐PEI：¹H NMR (400 MHz, D₂O, TMS)：δ = 2.64–3.51 ppm (m, PEI–H)，3.67 ppm (m, –CH₂NH₂)。
Deta‐PEI：¹H NMR (400 MHz, D₂O, TMS)：δ = 2.64–3.13 ppm (m, –CH₂CH₂NH₂, –CONCH₂CH₂)，3.25 ppm (m, –COCH₂, –CONCH₂)。
Leu‐PEI：¹H NMR (400 MHz, D₂O, TMS)：δ = 0.86 ppm (d, –CH₃)，1.58–1.64 ppm (m, –CHCH₃)，2.68–3.60 ppm (m, PEI–H)，3.9 ppm (m, –CHNH₂)。

聚合物取代度（DS）的计算：以Ga‐PEI为例，δ3.9 ppm处的特征单峰代表取代基上CH₂OH中的2H，而宽多重峰代表聚乙烯亚胺（PEI）的C–H信号（每个乙烯亚胺单元含4H）。因此，若取代度为100%，则这两个峰的峰面积比应为1:2。因此，DS可通过（实际峰面积比）/(1:2)计算得出。对于Ga‐PEI1，DS为(1:25)/(1:2) = 0.08，即8%。

2.4. 质粒DNA的扩增与纯化

使用了pGL‐3和pEGFP‐N1质粒。前者作为荧光素酶报告基因，转化至M109 Escherichia coli中；后者作为增强型绿色荧光蛋白报告基因，转化至E.coli DH5α中。两种质粒均在LB培养基中于37 °C、220转/分钟条件下过夜培养扩增。质粒采用EndoFree Tiangen™质粒试剂盒进行纯化，随后将纯化的质粒溶解于TE（Tris+EDTA）缓冲液中，并于−80 °C保存。通过琼脂糖凝胶电泳确认质粒的完整性，通过测定260至280纳米处紫外吸收的比值确定质粒纯度，结果约为1.91。

2.5. 琼脂糖凝胶电泳试验

在不同的聚合物相对于pDNA的重量比下，通过将适量的聚合物溶液加入到5 µL的pUC 19（0.025 mg/mL）中制备多聚复合物。所得复合溶液随后稀释至总体积为15 µL。在37 °C下孵育0.5小时后，将多聚复合物在含有GelRedTM的1%（w/v）Tris‐乙酸盐（TAE）电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶上以120伏电压电泳0.5小时。然后使用VilberLourmat成像系统在紫外线灯下观察脱氧核糖核酸。

2.6. 粒径和 ζ-电位在水中的测量

泽塔电位（ζ‐电位）和粒径采用马尔文仪器公司的Nano‐ZS ZEN3600仪器在25 °C下进行测定。该仪器配备波长为630纳米的红外激光，利用与激光多普勒流速测量相似的实验装置，通过散射光的相位分析测定颗粒的电泳迁移率（M3PALS技术，英国马尔文仪器有限公司，沃尔口问郡）。通过将1 mg pUC‐19加入适量的聚合物溶液（PBS中）制备不同w/w比例的多聚复合物。然后将多聚体溶液在37 °C下孵育0.5小时，并用去离子水稀释至1 mL后进行测量。数据基于三次独立实验，以均值±标准差（SD）表示。

2.7. 细胞培养

人成骨肉瘤（U‐2OS）细胞、HeLa细胞和人胚胎肾转化HEK293细胞在含10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%抗生素（青霉素‐链霉素，10,000 U/mL）的DMEM中，于含5% CO₂的湿润环境中37 °C培养。每隔一天更换一次培养基。

2.8. 转染程序

在U‐2OS、HeLa和HEK293细胞中研究了一系列复合物的基因转染。细胞接种于24孔板中（U‐2OS为10 × 10⁴细胞/孔，HeLa和HEK293为8.5 × 10⁴细胞/孔），在5% CO₂条件下于37 °C培养24小时至70%–80%细胞汇合度。转染前，更换培养基为含有不同质量比的聚合物/pDNA（1 µg）复合物的无血清或含10%血清的培养基。在标准培养箱条件下培养4小时后，更换为含血清的新鲜培养基，继续培养20小时。

在荧光显微镜检测中，细胞通过含有pEGFP‐N1的复合物进行转染。经过24小时孵育后，在倒置荧光显微镜（Nikon Eclipse TE 2000E）上配备冷凝尼康相机，在100×放大倍数下观察表达GFP的细胞。对照转染在每种情况下均使用市售的转染试剂bPEI（25 kDa）按照制造商规定的标准条件进行。

荧光素酶检测中，细胞使用含有pGL‐3的复合物进行转染。在24孔板中的典型检测中，转染24小时后，细胞用冷PBS洗涤，并用100 µL 1×裂解报告缓冲液（普洛麦格，美国威斯康星州麦迪逊）裂解。荧光素酶活性使用酶标仪（Model550，伯乐，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）测定。裂解细胞的蛋白含量通过BCA蛋白测定确定。基因转染效率以每毫克蛋白的相对荧光强度（RLU/mg蛋白）表示。所有实验均进行三份。

2.9. 细胞毒性检测

对人成骨肉瘤（U‐2OS）细胞、HeLa细胞和人胚胎肾转化HEK293细胞的毒性通过细胞计数试剂盒‐8（CCK‐8）测定。每孔7000个细胞接种于96孔板中，过夜培养至70%–80%细胞汇合度。弃去原培养基，更换为50 µL新鲜培养基，并加入50 µL不同浓度的多聚复合物加入以达到最终体积为100 µL。24小时后，向每孔中加入10 µL CCK‐8与90 µL PBS的混合液，继续孵育1小时。使用ELISA酶标仪（型号550，BioRad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）在450 nm波长下测定吸光度。经多聚体处理的细胞的代谢活性相对于未经处理的细胞对照（设为100%代谢活性）表示。此外，使用CCK‐8检测对未修饰的PEI进行细胞活力测定作为对照。

2.10. 蛋白质吸附实验

简而言之，将1毫升聚合物溶液（1 mg/mL）加入到1毫升牛血清白蛋白（BSA）溶液（2 mg/mL）中。在37 °C下振荡0.5小时后，聚合物吸附BSA形成白色棉状沉淀，通过离心去除。小心收集上清液，并用BCA蛋白测定法测定其中BSA的浓度。吸附在多聚复合物上的蛋白质含量通过以下公式计算：

q = (Ci − Cs) × V / m
其中，Ci和Cs分别为吸附实验前后的初始BSA浓度和上清液中的BSA浓度；V为溶液的总体积（2 mL）；m为加入溶液中的聚合物质量（1 mg）。

2.11. 质粒DNA的细胞摄取

通过流式细胞术分析聚合物/荧光素标记的DNA复合物的细胞摄取。根据制造商方案，使用Label IT Cy5标记试剂盒将质粒DNA用Cy5进行标记。简言之，将U‐2OS细胞接种于12孔板（2 × 10⁵细胞/孔）中，贴壁并培养24小时。进行无血清转染时，更换为无血清培养基；进行含血清转染时，更换为含血清培养基。细胞在37 °C下与Cy5标记的DNA复合物（2 µg DNA/孔，各样品的最佳重量比）在培养基中孵育4小时。随后，用含有肝素（120 U/mL）的1× PBS洗涤细胞，并用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化收集细胞，重悬于PBS中。使用FC 500流式细胞仪（Beckman Coulter，Brea，CA，美国）分析平均荧光强度。使用红色二极管激光器（633 nm）在FL4通道中检测Cy5标记的质粒DNA的摄取。对10,000个事件的数据，利用前向和侧向散射参数设门，以排除细胞碎片。每次运行前均校准流式细胞仪，使对照样品（即未经处理的细胞）的背景水平达到~1%。

2.12. 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析

U‐2OS细胞以每孔2 × 10⁴个细胞的密度接种于35 mm共聚焦培养皿（Φ = 15 mm）中，转染前24 h进行培养。无血清条件下的转染实验中，将培养基更换为无血清培养基；含血清条件下的转染实验中，则更换为含血清培养基。随后，将细胞与Cy5标记的DNA复合物（每孔2 µg DNA，各样品的最佳重量比）在培养基中于37 °C孵育4 h。之后，用PBS（pH 7.4）洗涤细胞两次以去除未被细胞摄取的复合物，接着用PBS缓冲液溶解的4%多聚甲醛固定10 min，并使用DAPI进行细胞核染色。采用Leica TCS SP5在激发波长405 nm（DAPI，蓝色）和633 nm（Cy5，红色）下进行共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察。

3. 结果与讨论

3.1. 酰化聚合物的合成与表征

本研究旨在合理设计并评估一类基于改性PEI的潜在安全非病毒基因递送载体。如图式1所示，目标聚合物由PEI 25 kDa与一系列具有不同氨基密度和亲水/疏水平衡性质的功能酸制备而成。除乙醇酸（Ga）外，其他含有伯胺基团的功能酸在与PEI反应前需用二‐叔丁基二碳酸酯（Boc₂O）进行保护。最终聚合物通过在水中透析（截留分子量：8000–14,000）3天并经冷冻干燥获得。通过调节功能酸的酸羧基与PEI上胺基的投料比，可得到不同的取代度（例如，投料比为0.1、0.2、0.3和0.5时分别得到Ga‐PEI1至Ga‐PEI4），取代度可根据¹H NMR谱图中的特征峰积分计算得出（见图1，详见实验部分）。计算得到的取代度列于表1中。考虑到PEI中1°/2°/3°胺基的空间位阻效应和反应活性差异，取代度始终低于羧基/胺投料比。目标聚合物的分子量通过GPC测定，表1中的结果表明，随着取代度的增加，Mw也随之增加。

表1. 聚合物的表征。DS由¹H NMR测得，表示PEI中全部氨基的取代度。Mw和多分散性（PDI）由GPC测得。

聚合物	取代度 (%)	Mw (千道尔顿)	PDI
Ser‐PEI1	6.8	31.9	1.67
Ser‐PEI2	9.3	32.6	1.66
Ser‐PEI3	14.8	35.8	1.80
Ser‐PEI4	19.0	37.0	1.71
Ga‐PEI1	8.0	29.4	1.55
Ga‐PEI2	10.0	31.0	1.63
Ga‐PEI3	15.9	32.6	1.68
Ga‐PEI4	18.2	33.3	1.68
Gly‐PEI1	4.0	28.5	1.54
Gly‐PEI2	8.7	30.5	1.58
Gly‐PEI3	13.3	32.7	1.60
Gly‐PEI4	25.0	35.2	1.70
Deta‐PEI1	6.5	33.2	1.88
Deta‐PEI2	10.5	36.0	1.77
Deta‐PEI3	12.5	37.3	1.96
Deta‐PEI4	15.4	42.1	1.90
Leu‐PEI1	7.0	32.3	1.56
Leu‐PEI2	10.3	34.6	1.71
Leu‐PEI3	13.3	36.6	1.78
Leu‐PEI4	21.1	46.4	2.37

3.2. 高分子/DNA复合物（多聚复合物）的形成

DNA的缩聚形成纳米级颗粒是高效递送DNA进入细胞的前提[13]。通过在不同质量比（聚合物/DNA，w/w）下进行凝胶阻滞实验测定修饰的PEI与质粒DNA的结合强度，结合能力以实现完全阻滞时的质量比表示[19]。图2显示，这些新材料在w/w质量比为0.8时即可观察到完全DNA递若，且DS不影响DNA缩聚能力[20]。在五种修饰中，Deta‐PEI表现出略低的结合能力。同时研究了多聚复合物的稳定性，发现随着肝素浓度增加，DNA可从多聚复合物中逐渐释放（图S1）。然而，需要比聚合物更多的肝素量才能实现释放，表明聚合物与DNA之间存在紧密结合作用。此外，还考察了DNA对核酸酶的保护作用，结果如图S2所示。经DNase处理后，裸DNA被降解，在凝胶上未观察到条带。相反，在与聚合物缩聚后，DNA能够抵抗DNase的作用，并可通过随后加入肝素释放。上述结果表明，这些聚合物可在含有核酸酶的环境中有效保护DNA不被降解[21]。

由于细胞通常摄取从微米到纳米级的粒子[22]，因此阳离子聚合物必须将核酸压缩成具有适当泽塔电位的纳米颗粒，而泽塔电位在内吞作用和材料细胞毒性中也起着重要作用[23]。采用动态光散射（DLS）检测测量了修饰的PEI与质粒DNA在0.5、2、4和8的w/w比例下形成的多聚复合物的直径和泽塔电位，并以未修饰PEI作为对照。每种聚合物的取代度（DS）根据荧光素酶基因转染实验（第3.3节）中确定的最佳取代度进行选择。如图3所示，总体而言，这些聚合物与PEI类似，可将脱氧核糖核酸压缩成直径在100至450 nm之间的颗粒，且当w/w比例达到~1时，多聚复合物的泽塔电位转为正值。随着质量比的升高，粒径减小而泽塔电位增加。由引入了羟基或疏水基团的Ga‐PEI或Leu‐PEI形成的多聚复合物表现出相对较低的泽塔电位。与此同时，源自Deta‐PEI的多聚复合物具有最高的氨基密度，导致其正电荷最高。然而，粒径似乎不受氨基密度的影响。Deta‐PEI仅在相对较高的w/w质量比8时产生最小的颗粒。还使用Ga‐PEI作为模型研究了取代度（DS）对多聚复合物粒径和电位的影响，结果（图S3）显示，随着DS的增加，粒径增大，泽塔电位降低。这可以通过羟基数量增加引起的正电荷屏蔽效应合理解释。

测得的不同修饰的PEI形成的多聚复合物的粒径（a）和泽塔电位（b）)

3.3. 体外基因转染

采用荧光素酶报告基因定量评估这些修饰的PEI在U‐2OS细胞中的体外转染效率。图4显示了这些聚合物在不同w/w比（2、3、4、5）下的相对转染效率，与PEI（25 kDa）在其最佳重量比1.4（N/P比= 10）时的情况进行比较[24]。氨基酸与PEI的偶联显著增强了荧光素酶的表达，其中甘氨酸修饰的Gly‐PEI表现出最佳的转染效率，约为PEI的10倍。取代度也影响其基因递送行为：对于每种聚合物，约10%的取代度最有利于转染。

众所周知，聚乙烯亚胺在含血清培养基中的转染效率会显著降低[25–27]。因此，开发在血清中仍能保持高效性的非病毒基因载体至关重要。在本研究中，还测试了具有最佳取代度的新制备聚合物的转染效率在10%血清存在的情况下。如图5a所示，与无血清条件下的结果（图4）相比，羟基修饰的聚合物比聚乙烯亚胺具有更好的血清耐受性。例如，Ga‐PEI的转染效率是PEI的六倍，而在无血清条件下该值为四倍。此外，Ga‐PEI对其他细胞系（包括HeLa）也表现出优异的转染效率（图5b）和HEK293（图5c）。在HeLa细胞中，转染效率比聚乙烯亚胺高出达23倍。在每种细胞系中，Ga‐PEI的转染效率高于Ser‐PEI，后者虽也含有羟基但保持了氨基的数量。这表明正/负电荷基团之间的平衡，也称为“羟基效应”[11,28]或电荷屏蔽效应[29,30]，对于这类聚阳离子的转染过程尤为重要，尤其是在含血清环境中。另一方面，Gly‐PEI也表现出良好的转染效率，但其相对于PEI的相对转染效率低于无血清条件下的结果。

U‐2OS；(b) HeLa；(c) HEK293)

此外，进行了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达检测以直接观察表达pEGFP‐Nl报告基因的被感染的细胞。图6显示了在荧光素酶检测中获得的最佳质量比下，修饰聚合物转染细胞的密度。结果表明，这些聚合物介导的转染效果优于涉及聚乙烯亚胺（PEI）的实验。此外，在有血清存在的情况下（图S4）或其他细胞系中（HEK293，图S5和图S6；HeLa，图S7和图S8）也进行了相同的检测。所有结果进一步证明了这些载体具有良好的血清耐受性。

3.4. 生物相容性研究

带负电荷的细胞和血液成分也会与阳离子聚集体相互作用，导致固有毒性[31]。涉及聚阳离子的转染通常伴随一定程度的细胞毒性，这可能会限制其作为基因递送载体的应用[32]。通过CCK‐8检测在不同浓度下研究并比较了这些PEI衍生物与未改性的25 kDa bPEI的细胞毒性。首先考察了取代度（DS）的影响。对于Ser‐PEI和Ga‐PEI，随着DS的增加，U‐2OS细胞的存活率略有上升（图S9），表明引入羟基可能有利于提高聚合物材料的生物相容性[14,19,28]。然而，对于其他PEI衍生物，并未发现这种依赖取代度的趋势[13]。随后测定了这五种具有最佳取代度的聚合物（其取代度与DLS研究中所用的相同）在不同细胞系中的细胞毒性，结果如图7所示。正如预期，这些改性PEI共轭物表现出明显低于PEI的细胞毒性，尤其是在正常细胞HEK293中。具有疏水侧链的Leu‐PEI显示出比其他聚合物更高的细胞毒性，表明疏水改性容易引发毒性，这可能是由于与细胞膜的增强相互作用[33–35]。

在五种聚合物中，Ga‐PEI表现出最低的细胞毒性。这可能归因于胺基被羟基取代，从而屏蔽了聚乙烯亚胺的正表面电荷（图3b）。

基因转染中的血清诱导抑制在很大程度上取决于多聚体与带负电荷的血清蛋白之间的非特异性相互作用[36–38]。抗蛋白质吸附能力可能有利于DNA货物竞争性地接近细胞膜，从而增强内吞作用和基因表达[39]。为验证这一假设，采用牛血清白蛋白（BSA）作为模型蛋白，模拟蛋白质在聚合物表面的非特异性吸附。如图8所示，与未修饰的PEI相比，修饰后的PEI表现出明显更低的蛋白质吸附，尤其是Ga‐PEI。这种对带负电荷蛋白质更高的抗吸附能力可能有助于其在血清条件下的更高相对转染效率（图5）。

U‐2OS；(b) HeLa 和 (c) HEK293 细胞的细胞毒性)

3.5. 细胞摄取和细胞内分布

为了深入了解目标聚合物促进的转染机制，通过流式细胞术分析了DNA的细胞摄取。在多聚复合物与U‐2OS细胞孵育4小时后，计算出Cy5标记的质粒DNA阳性细胞的百分比，并显示在图9a中。所有多聚复合物均表现出良好的细胞摄取，约90%的测试细胞对Cy5标记DNA呈阳性。尽管Gly‐PEI在荧光素酶检测中表现出最佳的转染效率（图4），但其细胞摄取并非最高。由于细胞摄取仅是基因递送过程中的多个障碍之一[28,40]，我们推测Gly‐PEI可能具有更高的细胞内效率来递送核酸。此外，在相同细胞系中还进行了含有10%血清条件下的细胞摄取实验。图9b所示结果表明，所有多聚复合物的细胞摄取均受到负面影响。然而，明显可以看出Ga‐PEI的摄取下降最少，这可能归因于其更强的电荷屏蔽效应（图3b）和更好的蛋白质吸附抗性（图8）。这也解释了其相较于其他聚合物具有更高的血清耐受性（图5）。

随后，在最佳转染质量比下，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）研究了这些聚合物在U‐2OS细胞中对递送的DNA（Cy5标记）的内化和细胞内定位。细胞核用4’,6‐二脒基‐2‐苯基吲哚（DAPI，蓝色）染色。如图10所示，在无血清条件下，所有多聚复合物在4小时转染后均可将大量DNA（红色）有效递送至核周区域以及细胞核中。然而，在含血清环境下，PEI介导的转染中红色荧光减弱。与此同时，修饰的PEI介导的转染中荧光密度未出现明显变化。对于Ga‐PEI介导的转染，在细胞核中发现了更多的红色信号，表明其作为非病毒基因递送载体具有更高的转染效率，尤其是在含血清环境中。

无血清；(b) 含10%血清)

4. 结论

支化PEI（25 kDa）通过与多种氨基酸或其他功能酸进行修饰，得到具有不同取代度的衍生物聚合物。采用不同的羧酸以赋予新聚合物不同的电荷和亲水/疏水平衡性质。这些聚合物可将脱氧核糖核酸压缩成具有合适尺寸和泽塔电位的纳米颗粒。体外实验表明，与PEI相比，它们能够实现更高的转染效率和更低的细胞毒性。使用Ga‐PEI作为转染试剂时，转染效率最高可达PEI的23倍。还研究了取代度和取代基团的影响，发现10%取代度最适于转染。在Ga‐PEI中，部分氨基被羟基取代，其在含血清条件下对多种细胞系表现出最高的血清耐受性和最高的转染效率。牛血清白蛋白吸附和流式细胞术检测也证实了其更高的生物相容性。这些结果可能为设计高效低毒的PEI衍生物作为非病毒基因载体提供指导。