基于患者细胞的3D药物筛选

使用患者来源细胞的用于药物组合高通量筛选的三维体外细胞培养装置

摘要

使用传统动物模型进行药物发现往往效率低下，因为测试用的动物模型无法准确反映人类反应，尤其是在毒理学和病理生理学方面。出于这些原因，迫切需要开发用于加速新药开发的体外人类疾病模型。精准医学尤其如此，目前的体外和离体模型不足以预测在人群和个体巨大异质性下的个体药物疗效和安全性。此外，在非生理条件下培养的模型细胞系无法重现患者组织复杂的微环境。利用患者来源细胞和药物联合疗法的精准医学可能是克服这些局限性的有前景的解决方案。三维(3D)细胞培养模型能够同时模拟复杂的体内组织微环境，并可微型化以利用有限的患者来源细胞进行大规模药物组合筛选。近年来，已开发出微流控和微阵列平台，用于模拟多个人类器官和人类特异性疾病状态，并在高通量药物筛选中得到越来越广泛的应用。本文重点介绍基于微流控的3D细胞培养装置（如器官/身体芯片系统）以及基于微阵列的3D细胞培养平台的当前发展状况，这些平台可与患者来源细胞相结合。利用患者来源细胞的微型化细胞培养系统是识别新药物组合以及药物协同作用潜在生物学机制的有力工具。

1. 引言

新候选药物的临床试验进展缓慢（10‐15年），成本高昂，且常常给患者带来沉重负担（Fogel, 2018）。绝大多数临床候选药物因安全性差、药代动力学特性不佳以及疗效不佳而失败（Arrowsmith & Miller, 2013）。降低候选药物高淘汰率的一种方法是开发能够模拟人体生理和疾病病理的模型系统。由于候选药物数量庞大，此类模型还应具备高通量特性，从而可能更准确地预测药物在人体中的疗效和安全性。

传统的二维(2D)细胞培养一直被使用，但这类模型在转化为复杂且异质的in vivo环境方面效果有限，因此对临床试验结果的预测能力较差（Stock 等，2016）。为了克服这些缺点，已应用能更好模拟in vivo环境的三维(3D)细胞培养方法进行药物毒性测试（Bell 等，2018），并在药物发现中提供了更高的精确性（Langhans，2018）。

生物打印设备已发展用于纳米和微米尺度的三维细胞培养微阵列，并且兼容自动化高通量筛选，有助于发现新的候选药物或已有药物的重新定位（Bishop 等，2017；Langhans，2018；Ozbolat, Moncal, & Gudapati, 2017）。微流控装置也已被用作多功能工具，通过持续的营养供应、废物清除以及维持氧气、CO2, pH和温度，实现类似的体内三维细胞培养模型（van Duinen, Trietsch, Joore, Vulto, & Hankemeier, 2015）。此外，微流控系统能够通过流体网络连接多个器官/组织细胞模拟物。基于这些优势，结合三维细胞培养的微阵列和微流控装置已在高通量药物有效性和毒性检测中得到应用。本文综述重点介绍可用于纳米和微米尺度三维细胞培养的生物打印和微流控装置，这些装置可与人肝细胞、人诱导多能干细胞、患者来源的癌细胞及其他人源原代细胞系结合使用，有望补充并逐步替代当前的动物实验。

2. 用于三维细胞培养的生物打印设备

已开发出多种细胞打印设备用于生成三维细胞培养微阵列。几乎所有细胞类型都可被整合到微阵列格式中，其小体积（数十纳升级至微升级）非常适合三维体外模型。接触式和非接触式打印设备均已被用于分配亚微升级体积的细胞（Jonczyk等，2016）。接触式打印通常使用微阵列针头通过与打印表面接触，将亚纳升级体积的细胞分配到玻璃或塑料载片上（Hart, Zhao, Garg, Bolusani, & Marcotte, 2009；Jonczyk等，2016）。该技术最初用于DNA/RNA寡核苷酸打印，但已有研究展示了固定细胞的打印应用（Hart, Zhao, Garg, Bolusani, & Marcotte, 2009；Jonczyk等，2016）。

或者，非接触式细胞打印技术已被用于将细胞以液滴形式喷出，而无需与打印表面接触（Jonczyk 等，2016）。该工具在细胞打印中得到了更广泛的应用，因为在该过程中活细胞的存活率得以保持（Jonczyk 等，2016）。目前已开发出多种非接触式分配模式，利用不同的机制生成细胞液滴。这些方法包括喷墨打印、电磁阀辅助打印、声学驱动打印以及激光辅助生物打印（Atala & Yoo，2015；Bakhshinejad & D’Souza，2015；Bishop 等，2017；Popova 等，2019；Tripathi & Savio Melo，2017）。这些方法可用于生成纳升至微升级体积的细胞悬浮液，因此非常适用于高通量筛选。若干非接触式打印工具可与现有的细胞培养格式（例如 96 孔、384 孔和 1536 孔板、玻璃片等）结合使用，在某些情况下仅需轻微的表面修饰即可构建三维基质，从而更准确地模拟in vivo环境。低体积与高通量能力相结合，使其非常适合针对患者来源细胞进行药物及药物组合筛选。

2.1 喷墨打印方法

压电喷墨打印利用一种材料（例如压电晶体或陶瓷），该材料在电信号作用下可产生机械运动，从而推动流体通过喷嘴（J. A. Park 等，2017年)。压电喷墨打印已结合多种不同的3D细胞培养形式使用，包括在3D基质中进行细胞包封以及逐层细胞沉积，这些方法可提供模拟天然组织结构的细胞外基质（ECM）环境（Matsusaki、Sakaue、Kadowaki 和 Akashi，2013；T. M. Park 等，2017）。压电喷墨打印非常适合打印胶原蛋白等高粘性材料，因此非常适用于三维细胞培养（T. M. Park 等，2017）。

逐层沉积可实现多组分细胞‐蛋白质混合物的添加，且点样大小可控（松崎等，2013）。此外，细胞和蛋白质混合物可以相互堆叠，从而能够在结构代表性条件下研究细胞，例如模拟肝组织的层级结构以用于药物代谢研究（松崎等，2013）。

2.2 电磁阀辅助打印方法

电磁阀辅助打印使用一种阀门，该阀门在电磁力作用下能够打开以喷出液滴（达塔、乔希和李，2015）（图2）。通过调节阀门开启时间，可控制分配的液滴的尺寸和体积。该方法已广泛用于细胞‐基质溶液的打印，以创建不同细胞类型的三维模型。例如，通过机器人电磁阀分配细胞‐基质胶混合物，打印出肝上皮细胞和永生化神经干细胞的三维细胞培养，已被用于药物毒性及干细胞分化研究（权等，2014；尼罗德等，2016）。在这些研究中，制备了三维微阵列，每个60 nL微阵列点包含特定的细胞培养、基质和培养基添加剂。总共在显微镜载玻片大小的生物芯片上运行了532个独立细胞培养。

2.3 声学驱动打印方法

声学驱动打印通过向液体施加脉冲频率的声波来产生液滴（Foresti 等，2018）（图3）。通过简单调节频率，即可实现纳升级液体的转移。已使用此类声学驱动和压力驱动工具生成了多种癌细胞系的3D肿瘤球体（Popova 等，2019）。例如，所生成的3D肿瘤球体被用于三种已知抗癌药物（如阿霉素、奥沙利铂和5‐氟尿嘧啶）的药物筛选，从而验证了既往关于癌细胞在三维与二维条件下相比具有增强的耐药性的结果。该技术可适用于研究患者来源细胞，以进一步在临床导向的应用中研究多种药物治疗方案的影响（Popova 等，2019）。

3. 基于微阵列的三维细胞培养系统在药物发现中的应用

在过去十年中，已开发出多种三维细胞培养微阵列技术以促进药物发现。微阵列平台非常适合用于高通量筛选多种生物学结果，包括药物毒性与疗效、靶点结合以及基于细胞的表型分析。已有报道采用水凝胶基质（丁等人，2017；康等人，2016；肖瓦尔等人，2017；沃辛顿等人，2017）、三维悬滴（郭等人，2017；童等人，2011；范德斯托尔佩和登通德，2013）、液体覆盖层（切利等人，2014；伊万诺夫和格拉博夫斯卡，2017）及其他技术的基于微阵列的三维细胞培养方案。用于三维细胞培养的微尺度生物打印方法也适用于共培养模型。当试图模拟真实的类组织环境时，这一点尤为重要。例如，在使用三维包封模型研究阿霉素毒性时，癌细胞在共培养中的存活率高于单层培养（T. M. Park 等，2017）。类似地，一种逐层肝模型显示出增强活性某些细胞色素P450酶，从而对已知具有肝毒性的药物曲格列酮产生更具代表性的毒性剂量反应（松崎等，2013）。在这两种情况下，均能够在维持药物筛选所必需的高通量水平的同时，更准确地模拟in vivo结果，特别是针对特定患者来源细胞进行大量药物筛选。

在三维细胞培养微阵列强大功能的一个关键示例中，研究人员将细胞培养于微柱芯片上，作为一种高通量工具，通过导入多种药物代谢酶（DMEs）基因，以研究代谢对肝上皮细胞肝毒性的影响（权等，2014）。这些基因通过腺病毒载体导入。DMEs负责肝脏中药物的毒化和/ 或解毒过程。因此，患者对特定药物的毒性反应在很大程度上受到这些DMEs表达水平的影响。然而，并非所有患者的DMEs表达谱都相同，因而潜在治疗方案在不同患者中可能产生不同的反应。因此，利用数量通常有限的患者特异性细胞来研究治疗效果，以捕捉这种变异性显得尤为重要（权等，2014）。该高通量平台使用极少量的细胞（每样本60 nL），鉴定出六种表现出不同IC50值的肝毒性药物，其差异取决于所导入的DMEs类型。这些不同的IC50值归因于DME活性，导致生成的代谢物相较于原药更具或更少毒性。因此，该微柱/微孔芯片系统（图4）可被调整用于患者特异性药物筛选，同时能够在三维环境中利用极少量细胞进行细胞功能研究。

使用类似平台，尼罗德等（2016）揭示了一种药物在未分化神经祖细胞系与其分化后代之间的毒性差异，这一发现可能与人类发育相关（卢兹和托卡尔，2018）。因此，不仅可研究药物对细胞的直接作用，还能研究药物对细胞分化的影响。尼罗德等（2016）利用微柱/微孔平台（图4）发现，在测试的24种药物中，有5种药物在未分化和分化的神经干细胞之间表现出不同的毒性。这些改变的反应可能与细胞在未分化状态下的增殖能力相关。这些结果表明，高通量平台有助于更深入地理解药物毒性的机制。此外，该平台能够长期培养细胞、诱导细胞分化并进行蛋白质水平表征，这意味着可以评估早期接触药物/化合物所导致的有害效应。这一结果提示，可以在重编程为多能干细胞的患者来源细胞上进行药物毒性谱分析，从而构建用于治疗筛选的患者特异性器官型模型。

微阵列分配装置可能难以直接分配高粘度的细胞支撑支架（例如海藻酸盐、胶原蛋白和基质胶）。因此，人们倾向于构建无支架3D模型。此类模型利用细胞培养平台的特性来生成球状体或类器官结构（李志浩、李、金、金，2016）。在构建用于药物筛选的患者来源细胞肿瘤模型时，这些方法尤为重要。目前已有多种市售的超低吸附培养板以及用于生成悬滴球状体的培养板被用于对已建立的细胞系进行药物筛选（加拉泰努等人，2016；塞尔比等人，2017 年)。由于液体处理设备的最新进展使得能够从源头转移极少量液体，因此可将含有极少量细胞的细胞悬浮液转移至支持球状体形成的培养板中。通过这些方法形成的3D细胞结构可用于快速药物筛选。

4. 用于三维细胞培养的微流控装置

用于生物应用的微流控技术起源于20世纪90年代初的半导体制造技术，并呈指数级发展（李X.、Valadez、左、聂，2012）。通过对流体流动的精确控制，通常在微升至皮升级范围内，在尺寸为数十至数百微米的通道网络中，各种芯片实验室（LOC）、微全分析系统（μTAS）或即时检测（POC）技术已经出现。微流控装置已通过使用玻璃、硅、聚合物（包括聚二甲基硅氧烷（PDMS））和纸的光刻技术制造而成（Gupta 等，2016）。特别是，微流控已成为构建基于三维复杂基质环境的微型化细胞培养方法中的关键组成部分，这些环境可模拟人类体内微环境。

为了提高这些体外模型的生理相关性，可在微流控芯片平台中使用多种细胞外基质材料，包括胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、海藻酸盐、壳聚糖、明胶以及其他合成生物材料（Ahadian 等，2018）。微流控网络的一个优势是其互连性，使得不同细胞类型可通过可控流体流动相互连接，以模拟体内环境（图5）。此外，由于微流控平台能够向细胞递送可溶性生长因子以及精确控制的化学成分梯度，因此这类平台特别适合维持多种相互连接的三维细胞类型，例如用于三维微血管网络模型（Polacheck、Zervantonakis 和 Kamm，2013；申等人，2012；范杜伊宁等人，2015；Wang、Sun 和 Pei，2018）、干细胞衍生脑模型（Hartlaub、McElroy、Maitre 和 Hester，2019；Karimi 等，2016）、三维肝类球体模型（Trietsch、Israels、Joore、Hankemeier 和 Vulto，2013）以及器官芯片和人体芯片操作（Ferretti, Bruni, Dangles‐Marie, Pecking, & 贝莱特，2007；波拉切克等人，2013；申等人，2012；范杜伊宁等人，2015；朱、庞和余，2012）。

为此，已开发出用于模拟人体器官微结构和功能的器官芯片装置，例如肺、肠、肾、肝、肠道、皮肤、骨髓以及神经和血脑屏障等（伊村、佐藤和吉村，2010；伊村、吉村和佐藤，2013；木村、池田、中山、酒井和藤井，2015；木村、酒井和藤井，2018；辛等人，2004；宋、卡姆和舒勒，2010；宋和舒勒，2009；宋等人，2014）。通过将这些细胞类型相互连接，形成了芯片上人体范式（木村等人，2018；宋等人，2014；B. 张、科罗利、赖和拉迪西奇，2018）。这些在单个芯片上集成多种器官类型的系统被设计用于模拟人体生理学多个方面的系统功能。例如，格里菲斯团队在微流控平台上实现了7‐10种器官类型的互连，包括肠道/免疫、肝/免疫、肺、子宫内膜、心脏、脑、胰腺、肾、骨骼肌和皮肤。这些细胞类型在三周内保持稳定，未丧失表型功能（Edington 等，2018）。

这种方法在模拟潜在的药物处置方面尤为重要，包括药代动力学以及药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）（Edington 等，2018；H. 李等人，2017）。此类见解对于在各种发现与开发方案中筛选出不合适的候选药物至关重要。该方法还有望通过从患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）生成特定组织类型，获得个性化的体外 ADMET和药代动力学数据。因此，可以针对个体患者预测药物毒性及最佳药物剂量（Y. Y. 李和琼斯，2012），特别是患有特定疾病的个体。

使用患者特异性细胞的这些基于器官的芯片平台所收集的数据，可应用于药物发现过程各个阶段的药物安全性和有效性验证，从而降低研发管线的风险（Ronaldson‐Bouchard & Vunjak‐Novakovic, 2018）。总体而言，结合合成微血管网络的患者来源细胞三维模型必将为病理生理机制和转化医学提供重要见解。然而，随着微流控复杂性的增加，更高的生理相关性是以降低通量为代价的（图5）。表1总结了用于药物发现的微流控灌注三维细胞培养装置的当前实例。

模型	细胞类型	共培养	应用
球状体‐on‐a‐Chip	细胞系：T‐47D, HCT116, A549, MRC‐5, H1650, MC3T3‐E1 干细胞：小鼠胚胎干细胞(mESCs)，etc.	未使用	Drug 疗效/毒性 评估（陈, 楼, 张, 英格拉姆, 和 尹, 2015；克瓦皮舍夫斯卡, 米哈尔丘克, 雷布卡, Kwapiszewski,& Brzózka, 2014)
	干细胞：人类神经干细胞（hNSC）	未使用	胶原蛋白，海藻酸盐 神经元细胞 分化 模型（张，魏，曾，徐，& 李，2017年）
	细胞系：HepG2, 3T3 成纤维细胞,人类脐静脉内皮细胞(HUVECs) 干细胞：骨髓来源的人类间充质干细胞,小鼠胚胎干细胞细胞（mESC）	使用	纤维蛋白，基质胶 胶原蛋白 微血管网络模型 Bone‐marrow 模型 神经网络模型 肝脏模型 肺模型 肾脏模型 肠道模型 干细胞衍生的脑模型（哈特劳布等人，2019；全等人，2014；卡里米等人，2016；木村等人等，2015；木村等，2018；齐等等，2016；鸟泽等，2014）
器官芯片 a‐Chip	细胞系：人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)，HT1080，MDA231 患者来源细胞：间皮瘤组织 肺组织	使用	基质胶，胶原蛋白，透明质酸(HA) 明胶，基质胶 癌症迁移/侵袭模型（Polacheck 等，2013；van Duinen 等，2015；Zervantonakis 等，2012） 肿瘤类器官模型（Aref 等，2018；马佐基，拉詹，沃塔诺普洛斯，霍尔，& 斯卡达尔，2018）
人类‐on‐a‐chip	细胞系：HepG2, 海拉 干细胞：诱导多能干细胞(iPSC)	使用	基质胶 胶原蛋白 ADME模型 体外药代动力学模型（Edington et al., 2018；李 H. 等，2017；B. 张等，2018）

5. 使用患者来源细胞的药物开发

传统的癌细胞系培养方法可能引发显著的选择压力，只有能够良好适应常规培养条件的细胞才能存活。这可能会歪曲原始肿瘤的生长特性（Iorio 等人，2016），而原始肿瘤通常增殖能力较低（Gazdar 等人，1998；Ince 等人，2015；McCallum 与 Lowther，1996）。体外培养患者来源细胞的技术已通过使用化学成分明确的培养基（Ince 等人，2007；Ince 等人，2015）、基于细胞外基质（ECM）的类器官培养方案（保罗等人，2017；Sato 等人，2011；van de Wetering 等人，2015）以及三维共培养方法（Edmondson、Broglie、Adcock 与 Yang，2014；Gaebler 等人，2017；Jaganathan 等人，2014）得到改进。在类器官和三维共培养方法方面，体外三维模型的基因谱型、表型特征和异质性组成似乎与原始患者来源的肿瘤高度保守（Fujii 等人，2016；保罗等人，2017；van de Wetering 等人，2015；Weeber 等人，2015）。患者来源细胞培养技术的进步推动了生物医学研究的发展。

患者来源的异种移植（PDX）模型已通过多种方式建立。其中最有效的方法可能是将患者肿瘤碎片直接植入免疫缺陷小鼠体内（Annibali、Leucci、Hermans 和 Amant，2019）。因此，PDX 模型保留了肿瘤异质性和组织病理学特征，这些特征在肿瘤微环境内的细胞间相互作用中至关重要（J. Jung、Seol 和 Chang，2018；F. Zhang 等，2018）。因此，PDX 模型的抗癌药物反应可能与临床反应密切相关（Bihani 等，2017；Bruna 等，2016）。因此，患者来源的肿瘤异种移植模型（PDTXs）已成为多种人类肿瘤的强大临床前模型（Cassidy 等，2015）。尤为重要的是，PDTXs 有潜力降低癌症药物发现与开发中的淘汰率（Aparicio 等，2015，Gao 等，2015，Hidalgo 等，2014，Tentler 等，2012）。然而，由于成本和动物福利的原因，在高通量药物研究中广泛使用 PDTXs 是不现实的。此外，PDTXs 在异源宿主中使用时细胞功能可能发生改变，因此尚不清楚其是否能够保持原始肿瘤异质性。

5.1 体内 使用患者来源细胞的三维细胞培养模型

5.2 联合药物治疗的高通量筛选

联合药物治疗已被证明可提高疗效并减少单个药物的剂量，因为每种药物作用于不同且通常互补的靶点和信号通路（Sun、Sanderson 和 Zheng，2016）。例如，厄洛替尼（EGFR酪氨酸激酶抑制剂）与雷莫芦单抗（VEGFR2拮抗剂）的联合治疗通过同时阻断EGFR和VEGF通路，改善了EGFR突变的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的无进展生存期。重要的是，未出现额外或意外的毒性。该联合疗法目前正处于III期临床试验中（Nakagawa 等，2019年)，并且已有大量其他联合疗法的临床试验正在NSCLS患者中进行（Rotow 和 Bivona，2017年)。

除了临床进展外，还进行了药物组合的高通量筛选以识别协同组合（Au‐Yeung 等，2017；克里斯塔尔等人，2014；Holbeck 等，2017；Menden 等，2019；O’Neil 等，2016）。其中一个令人振奋的方向是将多种药物组合筛选与患者来源的三维细胞培养相结合。

表2。用于高通量药物筛选的商业化微阵列设备
公司
Microfab
MJ‐ABP‐01
Biofluidix
TopSpot
工程 Arts
微滴 技术
自动滴液 AD‐P‐8000
自动滴样龙门架
Biodot
ASFA定位器
Accela
PixSys, PreSys, MicroSys
Biodot
瓦格纳 i e 科学
isendix
Labcycte
生物系统

6. 未来展望

已报道患者特异性遗传和代谢异质性对药物反应的影响存在于临床实践和多种组学研究中（Myint 等，2018；Vogelstein 等，2013）。这是精准医学需求的核心方面（Ashley，2015；Collins 和 Varmus，2015）。为了开发更有效且安全的药物治疗方案，需要使用患者来源细胞的有效体外模型。最终，此类模型