光场显微镜及其在三维生物成像中的应用

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摘要：光场显微是一种具有大视场、快速三维成像能力的计算光学显微技术，在生物动态观测中具有极大的应用前景。本文使用基本光学元件设计搭建了光场显微镜，可供光学工程、生物医学工程等专业的学生拆装练习，从而加深对光场显微原理和系统结构的认识。通过对荧光微球以及斑马鱼血管的三维成像，展示了光场显微系统的性能。

关键词 光场显微镜；三维成像；生物成像

自从 2014 年诺贝尔化学奖被授予荧光蛋白的发现之后，荧光显微成像技术已成为当前生物医学研究的必备手段。其中，三维快速显微成像技术在生物动态观测中有着迫切需求，近年来得到迅速发展。光场显微镜是一种仅需单次曝光再经后期计算处理即可实现三维重构的新型光学显微技术，具有结构简单、成本低廉等优点，是《生物光子学》等相关课程的重要教学内容。但是，目前光场显微镜尚未商业化，不利于开展实验教学。本文结合作者在清华大学《神经光子学》课程的教学实践[1]，介绍了光场显微镜的原理、设计方法、系统结构及其生物医学应用。通过自行设计、搭建光场显微镜供光学工程、生物医学工程等专业的学生拆装练习，有利于同学们加深对光场显微镜原理及系统结构的认识。此外，本文将所搭建的光场显微镜应用于荧光微球以及斑马鱼血管成像，展示了其系统性能。

1 光场显微镜的原理与演变

光场成像最先应用于宏观成像领域。它通过在成像光路的中间像面处放置针孔阵列或微透镜阵列来同时记录成像光的强度与角度信息，进而还原出物空间的三维结构[2]。

2006 年，LEVOY 等人[3]首次将光场成像技术应用于显微成像，通过在传统的宽场显微镜的中间像面处放置微透镜阵列，并将相机放置于微透镜阵列的后焦面上，改装出了第一台光场显微镜。相较于其他先进显微镜，光场显微镜由于无需扫描成像即可计算重建出三维图像，在生物动态观测领域有着极大的应用前景。但是，当前光场显微镜仍存在空间分辨率差、对比度低、背景强等问题。为了提高空间分辨率，2013 年 Broxton 等人[4]提出基于波动光学模型的去卷积算法，相较于传统的数字重聚焦算法，实现了高空间分辨率的三维重构，但采用该方法在焦面附近存在较强的重构伪影。近期，人们又发展了傅里叶光场显微镜[5]，可有效地避免该伪影。此外，由于光场显微镜继承了宽场激发的特点，景深外区域的激发信号会影响景深区域内重构结果的对比度与准确性。为了消除背景、提高对比度与准确性，人们发展出与各种选择性激发技术结合而成的光片光场显微镜[6]、共聚焦光场显微镜[7]等，有效地消除了景深外信号的干扰，进一步提高了光场显微镜的性能。近年来，光场显微镜在以三维神经网络活动观测为代表的生物医学研究中发挥了重要作用。

2 光场显微镜的结构与设计

2.1 光场显微镜的结构

如图 1 所示，光场显微镜的工作光路如下：激发光经过激发端滤光片后通过二向色镜反射，再经过物镜（20×, 0.5NA, Plan Fluor 20×,Nikon）聚焦在生物样本上。激发光路调节为柯勒照明，均匀激发样本中的荧光蛋白，产生荧光信号。所发射的荧光信号经物镜收集，再经二向色镜与发射端滤光片后，到达三目镜（U-TR30-2, OLYMPUS）中的管透镜（f = 180mm），再经中继系统（f1 = 30mm, AC254-030-A, Thorlabs；f2 = 50mm，AC254-050-A, Thorlabs，用于匹配微透镜与物镜的 F 数）、微透镜阵列（MLA150-5C, dm = 150μm, fm = 5.2mm, Thorlabs）成像在处于微透镜后焦面的 CMOS 相机（DCC1240M，1024×1280 像素，像素尺寸：4.65