经典常用荧光染料——PE/APC/PerCP（二）

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二、藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC）

APC 与 PE 同属藻胆蛋白，是流式细胞术中亮度最高的染料之一，因发射红光、光谱干扰少，成为多色流式的 “核心高亮度通道”。

1. 天然APC

来源与结构：提取自蓝藻（如 Spirulina platensis），结构为 α、β 亚基组成的二聚体，每个亚基结合 藻蓝胆素（PCB）发色团，发色团数量多于 PE，因此荧光亮度更高；
光谱特性：
- 激发波长：主要激发光为 633 nm或 594 nm；
- 发射波长：最大发射峰约 660 nm（红光），信号可被 660/20 nm 滤光片捕获。

交联 APC（Cross-linked APC, clAPC）

clAPC 是 APC 的化学修饰形式，通过 “交联剂” 将 APC 分子连接成多聚体（如二聚体、三聚体），核心目的是进一步提升荧光亮度，用于检测 “极低表达” 或 “极稀有靶点”。

修饰原理：利用交联剂（如戊二醛、BS3）将多个 APC 单体的氨基（赖氨酸残基）交联，形成 APC 多聚体（clAPC）；
特性变化：
- 荧光亮度：比单体 APC 亮 2-3 倍（因多聚体含更多 PCB 发色团，可吸收更多激发光并发射更强荧光）；
- 光谱特性：激发（633 nm）和发射（660 nm）波长与单体 APC 基本一致，仅荧光强度提升；
- 稳定性：交联后分子结构更稳定，抗蛋白酶降解能力增强，但水溶性略有下降（需优化偶联工艺避免聚集）。

APC活化

无论是天然 APC 单体，还是经交联形成的 clAPC 多聚体，其分子结构均缺乏能与抗体稳定结合的高活性基团，需通过化学修饰引入活性位点，才能实现与抗体的共价连接。

活化的本质是通过化学修饰，为两种染料引入能与抗体反应的活性基团，具体作用机制完全一致：

• 引入活性位点：无论是天然 APC 还是 clAPC，均需通过 NHS 酯（如 Sulfo-NHS）或马来酰亚胺（如 Sulfo-SMCC）修饰，分别引入能与抗体氨基结合的 NHS 活性酯基团，或与抗体巯基结合的马来酰亚胺基团；

• 保证连接稳定性：活性基团与抗体反应形成的共价键（酰胺键、硫醚键），可避免实验中染料从抗体上脱落，确保流式检测时荧光信号稳定（天然 APC 活化后形成 “APC - 抗体” 偶联物，clAPC 活化后形成 “clAPC - 抗体” 偶联物，二者均依赖共价键实现稳定连接）。

性能优势
- 荧光亮度极高：比 PE 亮 1.5-2 倍，是检测极低表达抗原（如干细胞表面标志物、稀有细胞亚群分子）的首选；
- 光谱干扰少：发射波长在红光区，与 FITC（525 nm）、PE（575 nm）、PerCP（675 nm）的重叠度极低，适合多色流式（如 6-10 色）；
- 稳定性好：虽略逊于 PE，但仍远优于小分子染料，适合长时间实验。
主要应用

APC 因高亮度和低干扰，是多色流式的 “主力染料”：

- 稀有细胞检测：如循环肿瘤细胞（CTCs，标记 EpCAM-APC）、造血干细胞（CD34-APC）、调节性 T 细胞（Treg，CD127-APC，因 CD127 在 Treg 上低表达）；
- 高复杂度多色实验：在 8-12 色流式 panel 中，APC 常作为 “高亮度通道”，与 PE-Cy7（785 nm）、APC-Cy7（785 nm）等远红染料搭配，减少光谱重叠；
- 功能检测：如细胞因子检测（IL-4-APC、TNF-α-APC）、细胞凋亡（7-AAD 与 APC 通道区分，7-AAD 发射 670 nm，与 APC 轻微重叠，需补偿）；
- 临床与科研通用：从基础免疫分型（如 CD45-APC 作为白细胞通用标记）到临床疾病诊断（如淋巴瘤免疫分型）均广泛应用。

三、多甲藻黄素 - 叶绿素蛋白复合物（Peridinin-Chlorophyll-Protein Complex, PerCP）

PerCP 是一种从甲藻（如 Amphidinium carterae）中提取的天然色素复合物，因发射远红光、光谱独特，主要用于多色流式的 “补偿通道” 或 “高表达抗原标记”。

1. 基础背景

来源与结构：由多甲藻黄素（Peridinin，一种类胡萝卜素）、叶绿素 a（Chlorophyll a）和蛋白质组成的复合物，核心是 Peridinin 吸收光后将能量传递给叶绿素 a，最终由叶绿素 a 发射荧光；
光谱特性：
- 激发波长：主要激发光为 488 nm，与 FITC、PE 共享激发光源；
- 发射波长：最大发射峰约 675 nm（远红光），信号可被 670/30 nm 滤光片捕获。

性能优势与局限：
- 优势：发射波长在远红光区，与 FITC（525 nm）、PE（576 nm）的光谱重叠极少，适合多色搭配；
- 局限：
  - 荧光亮度低：仅为 PE 的 1/5-1/10，远低于 APC，不适合低表达抗原；
  - 光稳定性差：易发生光漂白，需快速检测，不适合长时间实验；
  - 易聚集：与抗体偶联后易形成聚集体，可能导致非特异性染色。

3. 主要应用

PerCP 因亮度低、光谱独特，应用场景相对局限，主要用于高表达抗原标记和多色补偿：

高表达抗原的多色标记：仅用于标记 “极高表达” 的分子（如白细胞通用标志物 CD45-PerCP、T 细胞标记 CD3-PerCP），因高表达可弥补亮度不足的问题；
多色流式的补偿调节：在 4-6 色实验中，PerCP 常作为 “远红通道”，与 FITC（绿）、PE（橙）、APC（红）搭配，减少各通道间的光谱重叠（如 PerCP 与 APC 发射波长接近，需轻微补偿，但与 PE 无重叠）；
替代方案对比：因亮度和稳定性不足，PerCP 逐渐被 PerCP-Cy5.5（PerCP 与 Cy5.5 串联，亮度提升 3-5 倍，发射 710 nm）取代，目前仅在传统实验或低成本需求中使用。

以上三种荧光染料综合来讲：

天然染料（PE/APC/PerCP） 是直接用于检测的 “基础工具”，亮度和光谱决定其应用场景（PE 通用、APC 高亮度、PerCP 远红）；
活化修饰（活化 PE / 活化 APC） 是 “原料工具”，用于制备标记抗体，服务于定制化实验；
交联修饰（clAPC） 是 “增强工具”，通过多聚化提升亮度，满足极致检测需求。

在实际实验中，需根据抗原表达水平、激发光源、多色搭配需求选择合适的染料，例如：低表达抗原选 APC/clAPC，高表达抗原选 PerCP，通用场景选 PE。

Home Algae Biotech（鴻藻生技股份有限公司）是一家国立海洋大学技术支持，坐落于中国台湾北部临海的藻类应用技术开发公司，于2020 年获科技部「新型态产学研链结—价值创造计划」研究经费补助，拥有自己的藻类种原库及规模养殖系统。团队成员专精于海藻选种、育种与规模养殖技术，后端富有蛋白质活性成分纯化萃取、抗体接合，及保健品开发等研发能量，生产流程取得 ISO9001 质量管理系统认证。

公司主产品「天然荧光标记蛋白」为现代生物医学研究及临床领域，如细胞观测、细胞分选（例：循环肿瘤细胞检测 (CTC)、细胞治疗）所不可或缺的试剂，其次，公司所生产之藻类萃取原料完成国际化妆品命名协会 (INCI) 登录，经工研院原料安全及功效测试报告支持，为美妆保养、保健营养品产业中越渐热门的配方选择。公司现为台湾抗体协会、英国 Pivotal Scientific Limited PSL Alliance 生技联盟成员。

主要提供：

Purified R-Phycoerythrin (R-PE) (Cat#HA201)

Activated R-Phycoerythrin (Activated R-PE) (Cat#HA202)

Purified Allophycocyanin (APC) (Cat#HA203)

Crosslinked Allophycocyanin (CL-APC) (Cat#HA204E)

Peridinin-Chlorophyll-protein (PerCP) (Cat#HA206)