环境DNA宏条形码技术，鱼类检测引物如何选择？

环境DNA（eDNA）宏条形码技术在鱼类多样性调查研究中的优势明显，相比于传统调查方式，eDNA宏条形码技术灵敏度更高，能够更好地揭示鱼类的丰富度，并且具有高时效性。然而，在使用这个技术的过程中，引物是至为重要的一个参数，直接影响着调查的结果。现在文献中使用的鱼类引物也有很多，它们有什么差别，如何进行选择呢？今天，小编就收集到的基于12S基因的八对鱼类引物和大家一起讨论。

引物信息

八对引物在12S基因上位置示意图

引物的初步选择

引物的初步选择可以通过模拟匹配的结果从4个角度统计评估：灵敏度、非特异度、科覆盖度和分辨率。壹健基于自建的12S条形码数据库对这8对引物开展了模拟比对分析，结果如下图：

12S鱼类引物模拟匹配统计结果

1.灵敏度

计算方法：该引物目标物种条形码数/数据库中目标物种条形码数。

灵敏度指引物对目标物种序列的识别能力，量化表现为匹配目标数据库序列的比例。其本质是引物结合位点（Primer Binding Site, PBS）在目标分类群中的序列保守性。

这8对引物模拟比对验证结果表明，L1091.H1478在鱼类类群中灵敏度最低，其他引物鱼类类群灵敏度都在50%~75%之间。

2.非特异度

计算方法：该引物非目标物种条形码数/数据库中非目标物种条形码数。

非特异度反映引物区分目标与非目标物种的能力，由引物结合区与非目标物种的序列差异决定。

这8对引物模拟比对验证结果表明，Teleo几乎不扩增鱼类以外的生物类群，而V12S-U对鱼类以外的物种类群检出率很高非特异度比较高。若样本中有非鱼类DNA，扩增其他物种类群可能性较大。

3.科水平覆盖度

计算方法：该引物目标物种覆盖科数/数据库中目标物种科总数。反映引物对目标生物类群高阶分类单元的兼容性。

这8对引物模拟比对验证结果表明，在鱼类中，除L1091.H1478在鱼类类群中科水平覆盖度最低，其他7对引物覆盖度都大于80%。

4.分辨率

计算方法：将所有物种的代表序列M按照相似度100%聚类划分为N个群，N/M*100%。

这8对引物模拟比对验证结果表明，在鱼类中，12SV5引物分辨率最低为75%，L1091.H1478和AcMDB07这2对引物分辨率最高为94%。

引物选择以实验验证结果为准

能否满足研究需求不能仅依赖模拟比对评估，还需结合不同生态环境进行实验验证。Yiwen Li等[3]对比了Mifish和Metafish在东湖的表现，发现尽管两者在物种鉴别能力和扩增偏差上难以直接比较，但Mifish在鱼类分类特异性和可重复性方面优于Metafish。此外，Chun Ming How等[9]在香港亚热带水域的河口和海洋站点使用MiFish和12S-V5引物检测了78个水样的脊椎动物多样性，结果显示引物对不同分类群的敏感性存在显著差异。

因此，选择鱼类引物时，可先基于模拟匹配的数据，选择灵敏度高、非特异度低、科覆盖度高和分辨率高的几对引物进行研究区域的实际样本实验验证，最终确定适合该区域和研究目标的引物对，以支持大范围实验的开展。

参考文献

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2. Bylemans, J., Gleeson, D. M., Hardy, C. M., & Furlan, E. (2018). Toward an ecoregion scale evaluation of eDNA metabarcoding primers: A case study for the freshwater fish biodiversity of the Murray–Darling Basin (Australia). Ecology and evolution, 8(17), 8697-8712.

3. Li, Y., Tang, M., Lu, S., Zhang, X., Fang, C., Tan, L., ... & He, S. (2024). A Comparative Evaluation of eDNA Metabarcoding Primers in Fish Community Monitoring in the East Lake. Water, 16(5), 631.

4. Xu, L., Yang, D., Wang, Y., Li, J., Guo, X., Zeng, C., ... & Shao, J. (2022). Environmental DNA Captures Variations in Fish Assemblages with Distance from Dams in Karst Reservoirs. Water, 15(1), 73.

5. Kocher, T. D., Thomas, W. K., Meyer, A., Edwards, S. V., Pääbo, S., Villablanca, F. X., & Wilson, A. C. (1989). Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proceedings of the National Academy of Sciences, 86(16), 6196-6200.

6. Riaz, T., Shehzad, W., Viari, A., Pompanon, F., Taberlet, P., & Coissac, E. (2011). ecoPrimers: inference of new DNA barcode markers from whole genome sequence analysis. Nucleic acids research, 39(21), e145-e145.

7. Westfall, K. M., Singer, G. A., Kaushal, M., Gilmore, S. R., Fahner, N., Hajibabaei, M., & Abbott, C. L. (2023). NAMERS: a purpose-built reference DNA sequence database to support applied eDNA metabarcoding. bioRxiv, 2023-10.

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9. How, C. M., Ip, J. C. H., Deconinck, D., Zhao, M., Yan, M., Cheng, J., ... & Qiu, J. W. (2024). Refining sampling efforts for fish diversity assessment in subtropical urban estuarine and oceanic waters using environmental DNA with multiple primers. Environmental DNA, 6(5), e70013.