高效适配体筛选：从基础理论到技术创新

1.介绍
适配体是合成的单链寡核苷酸（DNA或RNA），以高亲和力和选择性结合特定的靶分子。适体通常被称为“化学抗体”，与传统抗体相比，适体具有几个优点，包括较低的免疫原性，更容易进行化学修饰，在各种条件下具有更高的稳定性。它们能够识别范围广泛的靶标-从小分子到整个细胞，这使得它们在诊断、治疗和生物技术方面具有不可估量的价值。
适体的发现主要是通过SELEX（配体的系统进化通过指数富集）实现的，这是一种从大量寡核苷酸库中分离高亲和力结合物的迭代筛选过程。

图1：适体库筛选策略示意图

2.适配体的类型
适配体可根据其核酸组成进行分类：
DNA适体：这些由单链DNA组成，由于其稳定性，抗酶降解性和易于合成而被广泛使用。DNA适体已经成功地用于检测蛋白质、小分子，甚至金属离子。
RNA适体：RNA适体表现出更高的结构灵活性，允许与某些目标更强的结合。然而，它们更容易被核糖核酸酶降解，通常需要化学修饰（例如，2'-氟或2'- o -甲基取代）来增强稳定性。
异种核酸适体（XNA）：这些是化学修饰的核酸（如肽核酸[PNA]或锁定核酸[LNA]），旨在提高结合亲和力和对核酸酶的抗性。XNA适体在需要长时间稳定性的治疗应用中特别有用。
3.SELEX技术
SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment）是从大型随机序列文库中分离高亲和力适配体的最广泛使用的方法。这个过程包括反复的选择和扩增，以丰富与目标紧密结合的序列。
(1) SELEX的关键步骤：
①文库制备：生成一个合成的寡核苷酸文库，包含多达10^15个随机序列，两侧为引物结合位点，用于PCR扩增。
②结合选择：文库与目标分子（如蛋白质、细胞或小分子）孵育。与目标结合的序列被保留，而未结合的序列被洗掉。
③分离：结合序列通过过滤、磁珠捕获或毛细管电泳等技术从非结合池中分离出来。
④扩增：选择的序列通过PCR （DNA适体）或逆转录PCR （RNA适体）扩增。
⑤反选择（可选）：为了提高特异性，在负选择步骤中去除与非目标分子结合的序列。
⑥克隆和测序：经过几轮筛选后，对富集池进行克隆和测序，鉴定高亲和力适配体。
(2) SELEX中的关键考虑因素
①严格控制：调节结合和洗涤条件，消除弱结合剂，提高特异性。
②PCR偏倚：过扩增会导致次优序列占主导地位；优化PCR条件至关重要。
③selex后优化：截断、化学修饰和结构改进可以提高适配体的性能。
4.SELEX筛选不同靶点的类型
SELEX可适用于针对各种靶标（包括蛋白质、细胞、病毒和毒素）分离适配体。下面是最常见的变体：
(1) Protein-SELEX
这种经典的方法选择了针对纯化蛋白（如凝血酶、VEGF）的适体。它被广泛用于诊断分析和药物开发。
(2) Cell-SELEX
与protein-SELEX不同，cell-SELEX-02使用整个活细胞作为靶标，无需事先了解特定蛋白质即可发现针对细胞表面标记的适体。这种方法在癌症研究中特别有价值，像适体这样的适体已经被开发出来识别肿瘤细胞。
(3)病毒和微生物SELEX
可以选择适合病毒（例如SARS-CoV-2刺突蛋白）或细菌（例如大肠杆菌）的适体，从而在快速诊断和抗菌治疗中提供潜在应用。
(4)毒素和小分子SELEX
这种变异能识别抗毒素（如赭曲霉毒素A）或小分子（如ATP、可卡因）的适体，使其在环境监测、食品安全和法医分析中很有用。

                                                  图2：结构开关筛选适体示意图
5.高级SELEX技术
毛细管电泳- selex (CE-SELEX)：通过利用结合和非结合序列之间的电泳迁移率差异来提高分离效率。
微流体- selex：一种小型化，高通量的方法，减少试剂消耗，加速筛选。
体内SELEX：直接筛选生物体内的适体，确保生物系统的功能相关性。
6.未来展望与挑战
虽然适体体有着巨大的希望，但仍存在一些挑战：
(1)提高结合亲和力：部分适体的亲和力低于抗体，需要进一步优化。
(2)可扩展性：大规模生产治疗适体需要具有成本效益的合成方法。
(3)监管批准：只有少数基于适配体的药物（如治疗黄斑变性的Pegaptanib）获得批准，这表明需要更多的临床验证。
尽管存在这些障碍，但SELEX技术的进步，包括自动化和机器学习辅助设计，正在加速适体的发现。未来的应用可能扩展到靶向药物输送、精准医疗，甚至纳米技术。
适配体，包括DNA适配体，RNA适配体和化学修饰的变体，代表了一类强大的分子识别工具。SELEX技术使他们的发现针对不同的目标，从蛋白质到整个细胞（细胞SELEX）。随着筛选方法的发展，适体有望彻底改变诊断、治疗和生物技术，为传统抗体提供一种多功能的替代方案。

References

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