【文献速递】基于minigene技术探究SMN1无义突变触发的mRNA衰变机制（NMD）

脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy,SMA）是一种常见的常染色体隐性神经肌肉疾病，由生存运动神经元1基因（SMN1）突变引起。SMN1基因突变中约40%为无义或移码突变，这类突变会引入提前终止密码子（Premature Termination Codon,PTC）。无义介导的mRNA衰变（Nonsense-Mediated mRNA Decay,NMD）是一种高度保守的真核质量控制途径，能够降解含有PTC的mRNA，防止潜在有毒蛋白的积累。然而，SMN1基因中不同PTC突变触发NMD的能力存在差异，需要进一步评估。本文将基于minigene系统，对研究文献“Premature termination codons in SMN1 leading to spinal muscular atrophy trigger nonsense-mediated mRNA decay”进行深入解读。

研究者选取了三种导致SMA的SMN1无义突变：c.43C>T、c.683T>A和c.844C>T，分别位于外显子1、5和7。构建包含这三个突变的SMN1-minigene，并将其转染到HeLa细胞中。通过体内剪接分析、环己酰胺（CHX，NMD抑制剂）处理和siRNA介导的UPF1（NMD关键因子）敲低等方法，研究这些突变对NMD途径的影响。

图1 minigene实验验证SMN1剪接变体的转录分析结果

野生型minigene（WT）仅产生正确剪接的转录本（FL-SMN1），即所有外显子（1、5、7和8）都被包含，内含子完全被移除。这表明构建的SMN1-minigene系统正常工作，能够产生正常的转录本。c.43C>T突变型minigene产生了两种不同的转录本,主要转录本是FL-SMN1。

次要转录本较长，经过测序分析发现包含了176bp的片段，该片段包含内含子1的155bp、XbaI限制位点TCTAGA以及内含子4的15bp。c.844C>T突变型minigene：产生了FL-SMN1转录本和一种较少见的较短转录本。经过测序分析，较短的转录本被鉴定为跳过了外显子5和7的转录本。

图2 NMD机制验证实验

经CHX(NMD抑制剂)处理后，突变细胞c.683T>A和c.844C>T中FL-SMN1的水平显著增加，说明NMD在这些细胞中活跃，且CHX能够抑制NMD，增加NMD底物转录本的水平。敲低UPF1(NMD关键因子)的表达可显著增加突变细胞c.683T>A和c.844C>T中FL-SMN1的转录本水平，进一步证实了这两个突变激活了NMD。而c.43C>T突变未触发NMD，其转录本水平不受CHX和UPF1敲低的影响。

本研究揭示了SMN1基因中不同PTC突变对NMD途径的影响，表明c.683T>A和c.844C>T突变可触发NMD，而c.43C>T突变则不能。这一发现对于理解SMA的发病机制具有重要意义。NMD在SMA的发病过程中可能扮演双重角色，一方面可能消除编码截短蛋白的转录本，防止其产生潜在毒性；另一方面，若截短蛋白保留部分正常功能，NMD的激活可能导致更严重的疾病表型。研究结果提示，在探索SMN1基因突变的致病机制时，应充分考虑NMD的影响。

 

参考文献

Zhang, Mengya, et al."Premature termination codons in SMN1 leading to spinal muscular atrophy trigger nonsense-mediated mRNA decay."Clinica Chimica Acta 530 (2022): 45-49.