转录组测序（质控、比对、计数）

测序文件下载：

通过NCBI中的SRA搜素物种名称，获得相应的转录组数据链接，找到自己需要的数据

文件下载：推荐迅雷

Linux系统安装软件：

conda（万能conda，安装方式自行百度）

conda install sratools

1.1 SRA转fastq：

fastq-dump --gzip -I --split-3 SRR编号 

如果为双末端测序，则出现两个文件

1.2 测序数据信息统计查看（fastqc）

conda install fastqc

fastqc -t 12 -o out_path sample1_1.fq sample1_2.fq

t 为线程数，-o 为输出目录，后面为样本1，样本2的测序文件

注意：如果有接头，需要过滤，通常fastp或者Trimmomatic

1.3 质控：

conda install fastp

单末端测序：

fastp -i xxx.fastq.gz -o xxx.fastq.gz

其中i为input文件，o为output文件

双末端测序

fastp -i xxx_1.fastq.gz -I xxx_2.fastq.gz -o xxx_1clean.fastq.gz -O xxx_2clean.fastq.gz

例如： fastp -i SRR6375815.1_1.fastq.gz -I SRR6375815.1_2.fastq.gz -o SRR6375815.1_1clean.fastq.gz -O SRR6375815.1_2clean.fastq.gz

用小写-i和-o规定R1文件，用大写的-I和-O规定R2文件

1.4 比对（hisat2）

conda install hisat2

建立基因组索引：

hisat2-build xxx.dna.primary_assembly.fa /data/genome 1>hisat2-build.log 2>&1

例如： hisat2-build /gss1/home/reference/cucu.fa /gss1/home/genome 1>hisat2-build.log 2>&1

其中：
xxx.dna.primary_assembly.fa 是指我们的基因组序列
/data/genome 是指我们生成的参考基因组放置的位置和前缀
1>hisat2-build.log 2>&1 是指生成的日志文件和报错文件存入hisat2-build.log里面

单末端测序文件：

hisat2 --new-summary -p 2 -x ../data/genome -U xxx.fq.gz -S xxx.sam --rna-strandness R 1>xxx.log 2>&1

双末端测序文件：

hisat2 --new-summary -p 2 -x ../ref/genome -1 xxx.fq.gz_1 -2 xxx.fq.gz_2 -S xxx.sam --rna-strandness RF 1>xxx.log 2>&1

其中
-p 是指线程数，可以根据具体条件自己调节
-x 是指我们之前构建的参考基因组的位置和前缀
-1 是指样本的R1文件
-2 是指样本的R2文件
-S 是指输出文件的名字和格式，一般使用sam格式
–rna-strandness 是指链特异性测序，在双末端测序中使用 RF 参数

1.5 整理和排序

conda insatll samtools

samtools view -S SRR6375805.sam -b > SRR6375805.bam

samtools sort SRR6375805.bam -o SRR6375805._sorted.bam

samtools index SRR6375805._sorted.bam

比对效率：samtools flagstat -@ 8  HISAT2.bam

1.6 reads 计数

featureCounts -p -a 2.gtf -o counts.txt SRR6375805_sort.bam 

gtf为参考基因组的注释文件，可以用gffread 将gff3格式进行转换，这一步消耗多的内存