1流式细胞术荧光比值计算_你的流式细胞仪检测光子的能力如何?

1 简介

在流式细胞仪中，粒子或细胞与聚焦激光束相交时的受激光激发和光电探测器对发射光的检测通常被认为是随机过程。取决于在时间采集窗口的时间间隔内最终到达光电探测器的光子数，在每个间隔内收集的特定能量(波长)波段的光子数的分布由泊松分布(<100个光子)或由中心极限定理(数百、数千或更多个光子)的高斯分布来描述。通用流式细胞仪通常能够检测给定细胞或粒子的几百到数百万个光子。虽然泊松分布通常是合适的，但较亮的光强分布在形状上可以很容易地认为是接近高斯分布的。

典型检测布局的示意图如图1所示。粒子或细胞暴露在一个紧密聚焦的激光或强光源下，从而发出散射光和荧光光信号。产生的光子由透镜收集，由反射镜或光纤引导到光学滤光片块，然后引导到光电探测器。粒子产生光子的效率取决于粒子/细胞内和粒子/细胞上荧光分子的数量和分布，或者如de Rond等人[1]的最新出版物所述，粒子/细胞的光散射截面。如果来自细胞/粒子的光发射是各向同性的(荧光和一些小粒子光散射信号)，则收集光学元件相对于粒子/细胞的位置将不重要，并且如果来自细胞/粒子的光发射是各向异性的(大多数大粒子光散射信号)，则收集光学元件相对于粒子/细胞的位置将是重要的。对于给定位置的收集光学元件，光收集光学元件的光收集锥角(数值孔径)将决定在该位置将收集多少光。收集到的光通过准直透镜、光纤和滤光片进行处理，并指向光电探测器。光通过(或被反射)每个元件和在每个元件表面时都会有丢失。即使每个元件表面(滤光片或透镜)的光损失很低，例如，1%，在6个元件表面后，损失为6%；在10个元件表面后，损失为10%，依此类推。因此，对于复杂的滤波器配置，总损耗可以快速累积，以便当光子到达光电探测器时，只剩下一小部分初始光子。光电探测器具有转换效率，可进一步减少转换为光电子以产生电流的光子数量。从激光激发粒子/细胞-通过光收集配置-到光电探测器的整体探测效率可能非常小，有时开始时大大低于百分之一。这种光的损失被称为探测效率，或Q。对于荧光粒子，Q指与细胞/粒子相关的荧光分子的数量。在de Rond等人最近提交的报告中，探测效率与总光散射总截面有关[1]。

图1 从激发光源开始，光子数在每一级处理后都会减少。随着光子数的减少，检测效率Q随着整个检测过程中增加更多处理环节而降低

2 光收集的关键方程

变异系数(CV)、标准偏差(SD或σ)和方差(SD2或σ2)都取决于由光电探测器光敏区产生的统计光电子(Spe)的数量(n)[2，3]。如图2所示，这些关系都是基于Poisson统计的，其中平均值的平方根等于SD(或σ)，并且

。系数C是每个Spe测量的总光子信号S的测量单位数(例如，通道、荧光分子、nm²等)。测量S包括目标信号和背景组成。因此，S包括目标光子信号、荧光、光散射信号等，加上背景信号、光子和/或电子信号。如果S用道数(channels)表示，那么C为道数channels/Spe，如果S用荧光分子表示，那么C为荧光分子/Spe，依此类推。如果C是荧光分子/Spe，则C =1/Q，其中检测效率Q以Spe/荧光分子为单位。

图2 四种不同的关系，显示了CV和SD(或σ)是如何与统计光电子(Spe)的数量(n)以及测量的单位S和S的测量单位之间的比例系数C有关的

读者可能想知道图2中哪种关系对给定的情况最有效。当S <0时，所有的关系都很糟糕。形式2(a)和2(c)是未定义的(或假想的)，形式2(b)和2(d)将产生假想结果，因为平方项总是正的。当S =0时，CV关系2(a)和2(b)将不起作用，因为S =0将产生除零误差。CV形式2(a)和2(b)是有利的，因为CV是无单位的，σ和S可以是任何单位，只要它们是相同的。但是，S必须减去背景分量B和任何其他偏移量。σ形式2(c)和2(d)对偏移量不敏感，但仍需校正以去除背景(B)成分。

3 荧光信号的检测效率

荧光信号的检测效率最早由Steen[2]提出，后来由Wood、Hoffman和Chase[3-5]对其进行标准化和校准。1998年10月，国际分析细胞学学会(ISAC，现为国际细胞测量学促进会)主办了一期细胞术专刊，A部分专门研究荧光检测。随后，在当前的细胞术方案(Unit1.20)中发布了一个计算检测效率(Q)、背景值(B)和分离参数(SP)(或分辨率)的协议[6]。用于计算Q和B的通用方程基于图2中的方程式2(d)，并使用C =1/Q。就有了：

(1)

式中，F是荧光分子(或通道)中的荧光强度，B是以与F相同的单位测量的背景强度。总信号S是F和B的总和。绘制标准偏差平方(SD2)与F的关系，得到斜率m等于1/Q，且y截距为B/Q的直线。y截距除以斜率m等于B。如果F和B是信道单位，则Q的单位是Spe/道数，这是信道与Spe值之间的比例因子。如果F和B是荧光分子单位(例如，等效可溶性荧光色分子[MESF]或等效数量的参考荧光团[ERF])，则Q是与每个荧光分子生成的Spe数量相关的检测效率。一般程序是使用一组多种校准微球，并计算每个荧光微球群体的平均道数和rSD或rCV。在通过减去用明亮微球测量的固有CV的校正值来校正暗淡微球的CV之后，用等式(1)对数据进行线性最小二乘拟合。计算出的Q和B可用于使用分离参数(SP)预测两个紧密间距微球的分辨率[6，7]。对于不可能完全均一的微球，Parks等人[8]扩展方程(1)包含微球的固有变异系数(CV_i)项，例如，尺寸、染料负载、光照等，给出

(2)

方程(2)有助于通过二次最小二乘拟合来增加可测微球强度的动态范围，因为它能更好地适应非常明亮的粒子，这些粒子的CVs是由细胞或粒子的固有特性决定的，以及与流体学和激光稳定性的物理测量变化有关，而不是由光子变化控制。

4 光散射信号的检测效率

在de Rond等人[1]提交的“流式细胞术中光散射效率和背景的量化”中，检测效率Q的概念被引入，即相对于总光散射截面σs的Spe/nm2数，等效的球形粒子，其有效总散射截面与各向同性散射光截面相同。这避免了较大粒子和非对称粒子的各向异性光散射发射的角度依赖性问题，并提供了一个简化的参考点。这不是一种直接的光子测量，而是一种物理性质，即细胞或粒子的光散射截面决定了散射光的强度。如前所述，探测效率Q是指虚拟光散射粒子。甚至背景B也是一个虚拟粒子，它散射的光强度等于检测到的背景光子。在其他实验室进行的进一步测试将确认de Rond等人的方法是否是一种合理和有用的简化方法，并确定该方法在比较不同仪器性能方面的效果。需要注意的是，光散射信号基于与测试粒子和仪器配置相关的内部和外部特性，如尺寸、折射率、不透明度、形状、光偏振、光源强度等。这与荧光粒子相反，荧光粒子基于与粒子偶联的染料发射荧光，而较少基于粒子的其他特征。标准化和校准的荧光粒子允许在仪器之间进行比较。作者提到，在确定适当的光散射质控粒子之前，仪器光散射信号比较可能很困难。

对于表观探测效率Q和背景B的测量，de Rond等人使用图2中的公式2(a)。作者遇到的挑战是，用一组多种校准微球很难测量固有变异系数。由于光散射固有CV来源于多种因素，很难制造或找到一组微球都具有一致的固有CV值。因此，作者们选择了一种微球，并在不同的激光功率下对微球进行评估。他们收集脉冲面积数据作为分析的输入。作者展示了背景CV测量是如何独立于激光功率的，这样他们就可以使用最高激光功率下的CV来校正低激光功率下的微球CV。作者开发了一种缩放或增益因子，允许他们测量任意通道单位的光子平均数和CVs，然后计算不同激光功率下的Q(单位：nm−2)和B(单位：nm2)。探测效率Q与激发激光功率成线性关系，B近似为常数。利用光散射Q和B测量，作者表明他们可以利用两个粒子群之间的分离参数(SP)来预测分辨率。因此，作者不仅证明了光散射信号的Q和B分析的原理，而且还证明了Q和B分析在预测亚群分离中的应用。

5 结束语

现在可以确定荧光测量和光散射测量的Q和B。知道Q和B，就可以计算两个信号之间和/或背景和微弱信号之间的预期分辨率。这种分析的其他应用是质谱和光谱分析。

质谱细胞术是基于应用质谱技术，利用抗体标签上的重离子来分离细胞类型。用质谱法检测重离子是一个随机的泊松过程。在图2的关系式中，它应该是可以计算的。到目前为止，关于质谱流式Q和B以及相关分离参数(SP)的测定还没有发表。有一个明确定义的分析来评估在检测带有少量抗体标签的细胞时，质谱细胞术与流式细胞术相比优劣将非常有用。也许在不久的将来，一个研究实验室将承担这项任务。

另在实现标准化和校准之前，光谱细胞术也是另一套需要更好理解的测量方法。到目前为止，还没有关于光谱细胞术的Q和B类型的测量结果发表。当然，单个光电探测器可以评估Q和B，但是这些值如何在变换后的光谱空间中转化为全方位的Q和B还没有发表。如果没有Q和B或等效值，就不可能使用分离参数(SP)的等效值来预测两个信号之间的分辨率，或者微弱信号和背景的分辨率。不仅存在光电探测器测量的光子误差，还包括误差如何通过计算光谱特征的计算机算法传播。没有这种类型的批判性分析，就不可能确切地知道哪种计算机算法和/或哪种仪器工作正常。为了验证光谱细胞术的定量能力，还需要找到光谱细胞术的Q和B等效物。

编者语

本文阐述了一些重要的性能参数如Q,B,SD,CV,SP等，以及其测定和计算的方法，相较传统流式有着更多的实践经验，而质谱和光谱流式还有许多的探索空间，这些参数对于仪器标准化、仪器性能体现、数据结果比较以及实验前的预判等都有着重要的意义。

ReferenceHow well can your flow cytometerdetect photons?James C. S. Wood First published: 02 December 2020 

https://doi.org/10.1002/cyto.a.24281

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