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2018年6月9日下午16:20-16:50 主题报告：

“人造精子”介导的基因编辑

哺乳动物单倍体胚胎干细胞的建立为生命科学研究提供了新的工具。2012年，我们建立了只携带精子来源遗传物质的小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞，并证明这一细胞能代替精子在注入卵母细胞后能支持胚胎发育产生健康的半克隆小鼠，即半克隆技术。然而，单倍体细胞的“受精”能力随着细胞的传代逐渐丢失，特别是经过基因编辑后，逐渐失去产生健康半克隆小鼠的能力。最近，我们通过将调控雄性印记基因H19和Gtl2表达的H19-DMR和IG-DMR敲除后获得了能稳定产生半克隆小鼠的“人造精子”的单倍体细胞，并证明它们能稳定高效支持获得遗传修饰的半克隆小鼠。重要的是，这些细胞携带CRISPR-Cas9文库，能够一步产生大量的携带不同突变基因的小鼠，从而为开展小鼠个体水平的遗传筛选提供了技术支持。进一步，我们证明卵子来源的孤雌单倍体胚胎干细胞在去除H19-DMR和IG-DMR后同样能够高效支持半克隆小鼠的发育。另外，我们还建立了食蟹猴和人的孤雌单倍体胚胎干细胞。与CRISPR-Cas9技术结合，“人造精子”介导的半克隆技术可以实现：(1)一步获得携带多基因突变的杂合小鼠模型，用于模拟人类多基因介导的复杂疾病；(2)快速获得携带人类疾病相关点突变小鼠用于研究疾病发生的分子机制；(3)一步获得针对不同基因的突变小鼠，实现小鼠个体水平的遗传筛选，便于从大量候选基因中快速筛选出重要基因进行深入研究；(4)建立携带蛋白标签敲入的“人造精子”，进而获得携带蛋白标签的小鼠，为实现全基因组蛋白标签计划(genome tagging project, GTP)提供技术保障。这些研究显示“人造精子”介导的半克隆技术为研究人类疾病和发育提供了一个新的手段。

代表性文章 ：

J Biol Chem: 建立过滤富集单倍体胚胎干细胞的方法

Qu C, Yan M, Yang S, Wang L, Yin Q, Liu Y, Chen Y & Li Jinsong. Haploid embryonic stem cells can be enriched and maintained by simple filtration. J Biol Chem 293 (14) (2018): 5230-5235.

单倍体胚胎干细胞因其只含有一套染色体，不会遮盖隐性性状，在研究基因功能上可提供很大的帮助。但是，美中不足，单倍体干细胞会自发二倍化，需要通过定期流式分选富集单倍体细胞的方法来维持单倍体特性。然而，该方法复杂、昂贵且对细胞会产生一定的损伤。为了解决这一问题，根据单倍体细胞与二倍化了的细胞的平均直径的差异，通过过滤的方法在体外稳定地维持单倍体细胞单倍体性超过30代。该过滤系统由商业化的一片布满5μm或8μm小孔的滤膜与一个滤膜的支撑装置，外加一个注射器组成。成本很低且均可实现无菌操作。对细胞活性及单克隆形成能力的研究发现过滤第一代细胞远优于流式分选富集的细胞。与此同时，过滤不同次数的单倍体干细胞仍能正常支持半克隆小鼠的出生。除此之外，该方法也可用于小鼠单倍体细胞的建立以及人的单倍体细胞的富集。过滤富集单倍体细胞的方法为单倍体细胞相关技术的发展、应用和推广提供了保障。

Cell Stem Cell: 建立“类精子细胞”的单倍体细胞系

Zhong C, Yin Q, Xie Z, Bai M, Dong R, Tang W, Xing Y, Zhang H, Yang S, Chen L-L, Bartolomei MS, Ferguson-Smith A, Li D, Yang L, Wu Y & Li Jinsong. CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library. Cell Stem Cell 17(2)(2015), 221-232.

能代替精子细胞使用的单倍体细胞系的建立为获取遗传编辑的动物模型提供了一种新的手段。然而，之前的研究显示，半克隆小鼠的出生效率低(4.5%左右)，而且约一半的半克隆小鼠出现发育迟缓的现象。分析原因发现，原本在精子细胞中不表达的雄性印记基因H19在单倍体细胞和发育迟缓的半克隆小鼠中出现高表达的现象，这暗示印记基因的异常表达可能是导致半克隆小鼠胚胎发育异常的关键原因，通过调控印记基因的表达有可能提高半克隆小鼠的出生效率。为了验证这一假设，研究人员从H19-DMR敲除的小鼠精子中建立了单倍体细胞系(H19-DMR敲除后，H19的表达下降)，发现将这些细胞注入卵子中后能显著提高半克隆小鼠的出生效率(达到8.7%)。然而，仍然有三分之一的半克隆小鼠出现发育迟缓的现象。进一步分析原因发现，在H19-DMR敲除的细胞和发育迟缓的半克隆小鼠中存在另外一个雄性印记基因Gtl2的异常高表达。为此，研究人员进一步在H19-DMR敲除的单倍体细胞中敲除了调控Gtl2表达的IG-DMR(IG-DMR敲除后，Gtl2表达下降)。令人惊奇的是，H19-DMR和IG-DMR敲除的细胞能高效产生半克隆小鼠，达到22%的出生效率，并且几乎不会产生发育迟缓的半克隆小鼠。“类精子细胞”的单倍体细胞系的建立使得利用这一细胞快速制备遗传编辑小鼠模型成为可能。为此，研究人员先后在H19-DMR和IG-DMR敲除的单倍体细胞中进行了多基因的敲除和敲入，建立了携带Tet1/Tet2/Tet3三基因敲除、P56/P63/P73三基因敲除以及Tet1-EGFP/Tet2-mCherry/Tet3-ECFP三基因敲入的细胞系，并证明这些细胞能稳定高效支持半克隆小鼠的产生。另外，将 H19-DMR和IG-DMR敲除的单倍体细胞能够携带CRISPR-Cas9文库，让单个的细胞携带一个sgRNA和Cas9核酸酶，通过注入卵子中则可以批量产生携带不同突变基因的半克隆小鼠，从而实现了小鼠个体水平的遗传筛选，从而填补了哺乳动物在个体水平进行遗传筛选的空白，为遗传发育研究提供了新的体系。

Cell: 建立小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞系

Yang H, Shi L, Wang B, Liang D, Zhong C, Liu W, Nie Y, Liu J, Zhao J, Gao X, Li D, Xu G-L* & Li Jinsong*. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell 149(3)(2012), 605-617.

研究人员采用了核移植的技术，即将卵母细胞的核通过显微操作的方法去掉，然后注入一个精子形成携带来自父本基因组的单倍体重构胚胎。这些胚胎在体外能够发育到囊胚，从这些囊胚中分离建立了单倍体胚胎干细胞系。单倍体胚胎干细胞系具有典型的小鼠胚胎干细胞特征，能够在注入两倍体囊胚中后形成嵌合体小鼠。因为精子在形成过程中会产生雄性印记状态，这种印记状态是受精后胚胎发育的重要保证，而且在整个发育过程中一直维持，因此，研究人员分析了单倍体胚胎干细胞系的雄性印记水平，发现这些细胞保持了一定的雄性印记。 接下来，为了验证这些细胞是否能像精子一样具有“受精”能力，研究人员将单倍体胚胎干细胞系注入卵母细胞中，发现部分“受精”的胚胎能够发育成健康的小鼠。最后，研究人员成功地利用单倍体胚胎干细胞系进行了基因打靶的尝试。单倍体胚胎干细胞系的建立为获取遗传操作的动物模型提供了一种新的手段，也为细胞重编程研究提供了一种新的系统。