PiSPA:一种新的单细胞蛋白组学分析工作流程，使用无标记定量方法实现深度鉴定-优快云博客

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今天依然是学习的一天，今天没有代码，纯纯的实验技术分享。鸟枪法蛋白质组学分析是目前最有前途的单细胞蛋白质测序技术，但其每细胞1000个蛋白质的鉴定水平仍然不足以用于实际应用。今天的新技术是单细胞蛋白组学样本前处理工作流—PiSPA（pick-up single-cell proteomic analysis），PiSPA工作流程是专门为单细胞样品建立的，主要基于纳升级微流控液体处理机器人，能够在拾取操作策略下实现单细胞捕获、预处理和进样。使用这种定制的工作流程，在蛋白质鉴定方面有显著的改进，在 DIA（MBR）模式下，在单个A549 细胞（n = 37）、HeLa 细胞（n = 44）和 U2OS 细胞（n = 27）中分别定量 2449-3500、2278-3257 和 1621-2904 蛋白质。

参考文献地址：https://www.nature.com/articles/s41467-024-45659-4
实验技术原理

PiSPA工作流程使用基于探针的微流控液体处理机器人进行细胞分选和预处理，使用带有自动进样器的商用液相色谱系统和tims-QTOF质谱仪进行。微流控液体处理机器人（a）与插入管阵列（b）以自动拾取操作模式完成了单细胞的分选和单细胞样品的多步骤预处理，包括单靶细胞的分选（c）、纳升级细胞裂解（RG、RapiGest SF）、蛋白质还原（TCEP、三（2-羧乙基）膦）、烷基化（IAA、碘乙酰胺）、酶消化（Lys-C）和终止消化（FA，甲酸）（d）。插入管与样品瓶耦合用作纳升微反应器，用于单细胞的样品预处理（b）。样品预处理后，将插入管和样品瓶用作液相色谱系统自动进样器的样品管，以执行样品进样（e）、液相色谱分离（f）和随后的MS检测单细胞中消化的肽组分（g，h）

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实验步骤

（1）在拾取模式下，它实现了基于细胞悬浮液样品中靶细胞的明场表观特性或标记荧光信号的自动明场或荧光成像和鉴定，通过与高精度注射泵连接的锥形毛细管探针拾取单个靶细胞，并将目标细胞分配到插入管中。我们评估了PiSPA平台的细胞分选性能，方法是使用它分别拾取20个单个HeLa细胞，并将它们分别分配到不同的插入管中。

（2）在探针捕获目标细胞后，控制平台将细胞分配到商业插入管中，而不是像之前报道的那样使用微芯片作为微反应器。插入管可以与商用LC-MS系统的自动进样器无缝兼容，无需微加工微芯片和麻烦的样品进样操作。单细胞样品预处理所需的纳升级微反应器，使用插入管的锥形底尖（内径2mm，高度0.4mm）来加载纳升反应溶液。此外，通过在插入管外的样品瓶中加入100μL水和密封盖，以形成内部高湿度环境，抑制了纳升反应溶液在加热反应过程中的明显蒸发效应。

（3）在蛋白质消化实验中，我们以单个HeLa细胞为样品，研究了酶/蛋白质比例对蛋白质识别数的影响。在常规蛋白质组学实验中，通常采用1：100至1：10的酶/蛋白质比例作为优化的消化条件。

实验结果