甘草次酸通过促进 Prdx6 和 caspase-3 介导的线粒体凋亡抑制非小细胞肺癌

甘草次酸（GA）作为甘草（Glycyrrhiza glabra L.）水提物中甘草酸的水解产物，是甘草的主要活性成分之一，已被证实具有抗增殖、抗炎及肝脏保护等多种药理活性。现有研究表明，GA 对肝癌、乳腺癌、前列腺癌及胰腺癌等多种癌细胞均能发挥抑制作用，其潜在机制可能涉及诱导细胞周期阻滞、抑制细胞增殖及促进凋亡；在肺癌领域，18β-GA 可通过调控细胞周期 G2/M 期、抑制 A549 细胞活性，或通过内质网应激通路诱导 NSCLC 细胞 G1 期阻滞等方式发挥作用。

然而，GA 对 NSCLC 的直接作用靶点及具体分子机制仍不明确，这一关键问题极大限制了其进一步的应用与转化。因此，本研究采用活性导向蛋白质谱（ABPP）技术，结合组织病理学与蛋白质组学验证，系统探究 GA 抑制 NSCLC 的潜在靶点及分子机制，旨在为 GA 在 NSCLC 相关研究中的应用提供理论与数据支撑。

细胞培养实验中，Lewis 肺癌（LLC）细胞，A549 肺腺癌细胞及 Calu-1 NSCLC 细胞均培养于含 10% 胎牛血清（FBS）及 1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 培养基中，置于 37℃、5% CO₂培养箱内培养。当细胞融合度达 80%–90% 时，分别用浓度为 1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800μM 的 GA 处理，以筛选最佳作用浓度；后续实验中，LLC 细胞被分为对照组（Ctrl）、GA-10μM 组、GA-20μM 组、Z-VAD-FMK 组及 GA-20μM+Z-VAD-FMK 组，同时设置加入 1mM ROS 清除剂 N - 乙酰半胱氨酸（NAC，AbMole）的处理组，以探究 ROS 在 GA 作用中的角色。细胞增殖能力通过 CCK8 法检测，严格按照试剂盒说明书操作，在 450nm 波长下测定吸光度值，计算细胞相对活力。

凋亡相关指标检测中，细胞凋亡率采用 Annexin V - 荧光素异硫氰酸酯（FITC）/ 碘化丙啶（PI）双染法。向细胞培养液中加入不同浓度 GA，孵育 12h 后收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 2 次，按试剂盒说明书加入 Annexin V-FITC 及 PI 染色液，室温避光孵育 15min，通过 Beckman 流式细胞仪检测并分析凋亡率。线粒体膜电位检测时，LLC 细胞用 JC-1 工作液 37℃孵育 20min，PBS 洗涤 2 次后，流式细胞仪检测红色荧光（聚合态 JC-1，正常膜电位）与绿色荧光（单体 JC-1，降低膜电位）的比值。钙离子浓度检测采用 Fluo-4 AM 探针，LLC 细胞以 3×10⁵个 / 孔的密度接种于 24 孔板，培养 24h 后用不同浓度 GA 处理 24h，加入 Fluo-4 AM 探针 37℃孵育 1h，PBS 洗涤 3 次，重悬于 500μL PBS 中，流式细胞仪检测荧光强度以反映胞内 Ca²+ 水平。

ROS 检测实验中，LLC 细胞以 1×10⁶个 / 孔的密度接种于 6 孔板，不同浓度 GA 处理 12h 后，加入 10μM DCFH-DA 探针 37℃孵育 1h，PBS 洗涤 1 次，流式细胞仪检测 488nm 激发光下的荧光强度，量化胞内 ROS 含量。细胞荧光成像实验用于