压力激素 CRF 如何守护肠道屏障？DSS 结肠炎模型中的免疫调控新机制

一、研究背景：当压力激素遇上肠道炎症​

炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，如同肠道内的 “慢性战争”，影响着全球数百万人的健康。尽管病因尚未完全明确，但越来越多的研究表明，先天免疫反应的异常在肠道稳态失衡中扮演着关键角色。 toll 样受体（Toll-like receptors, TLRs）作为先天免疫的 “哨兵”，能够识别病原体相关分子模式，启动免疫应答。其中，TLR4 作为脂多糖（LPS）的受体，其功能缺陷会导致肠道屏障功能减弱，增加结肠炎的易感性。​

CRF 作为下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴的核心调节因子，不仅是应激反应的关键分子，还在免疫系统中发挥着复杂的调节作用。在肠道中，CRF 由多种细胞分泌，包括免疫细胞和上皮细胞，但其在先天免疫依赖的结肠炎中的作用尚不明确。科学家们注意到，CRF 基因敲除（Crh⁻/⁻）小鼠存在糖皮质激素不足的问题，而糖皮质激素是重要的抗炎激素，这使得研究 CRF 的独立作用变得困难。然而，通过巧妙的实验设计，研究团队发现了 CRF 在 TLR4 表达调控中的新机制，为理解 IBD 的发病机理提供了全新视角。​

二、实验准备：构建精准的研究模型​

（一）实验动物的选择与饲养​

实验选用 129xC57Bl/6 遗传背景的 Crh⁺/⁺（野生型）和 Crh⁻/⁻（敲除型）雄性小鼠，体重 22-27g，年龄 8-10 周。小鼠饲养于温度 22°C、12 小时光照 / 黑暗循环的环境中，自由摄食标准饲料和自来水。每日监测体重、摄食量和饮水量，确保实验条件一致。​

（二）主要试剂与仪器​

• DSS 溶液：称取 dextran sodium sulfate（分子量 40kDa），配制成 3%（w/v）的水溶液，用于诱导结肠炎。​
• Dextran sulfate sodium salt | 9011-18-1 | AbMole | DSS

• 荧光素异硫氰酸酯 - 葡聚糖（FITC-dextran）：用于检测肠道通透性，分子量 4.4kDa，浓度 22mg/mL，溶于磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）。​
• FITC-Dextran (MW 4000) | 60842-46-8 | AbMole

• 抗体：TLR4 抗体（Santa Cruz Biotechnology）、β-actin 抗体（Sigma）、MyD88 抗体（自行制备或商业购买）。​

• 仪器：酶标仪（用于 ELISA 检测）、荧光显微镜（观察组织染色）、蛋白质电泳系统（Western blot 分析）、实时定量 PCR 仪（检测基因表达）。​

三、实验过程：抽丝剥茧探寻机制​

（一）DSS 诱导结肠炎模型的建立​

1. 分组与处理：将小鼠分为 Crh⁺/⁺对照组、Crh⁻/⁻对照组、Crh⁺/⁺ DSS 处理组、Crh⁻/⁻ DSS 处理组，每组 5-10 只。​

1. 给药方式：连续 7 天给予 DSS 处理组小鼠 3% DSS 饮用水，对照组给予正常饮用水。每日记录饮水量，确保小鼠摄入的 DSS 剂量一致。​

1. 临床指标监测：每天两次观察小鼠的精神状态、腹泻和血便情况，使用疾病活动指数（DAI）进行评分，包括体重变化、腹泻程度和便血情况。​

（二）肠道通透性检测​

1. 灌胃给药：在 DSS 处理第 7 天，小鼠禁食 4 小时后，灌胃给予 FITC-dextran 溶液（22mL/kg 体重）。​

1. 血液采集：5 小时后，通过颈静脉穿刺采集血液 150μL，3000rpm 离心 10 分钟，收集血清。​

1. 荧光检测：使用酶标仪在激发波长 485nm、发射波长 520nm 处测量血清中 FITC 的荧光强度，计算肠道通透性。​

（三）组织学分析​

1. 组织取材：处死小鼠后，迅速取出结肠，用冰生理盐水冲洗干净，截取 1cm 的横结肠组织，放入 4% 多聚甲醛中固定 24 小时。​

1. 脱水包埋：依次用梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成 5μm 厚的切片。​

1. H&E 染色：切片脱蜡至水，苏木精染色 5 分钟，水洗后伊红染色 3 分钟，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。​

1. 病理评分：由病理学家盲法评分，从炎症细胞浸润、上皮损伤、隐窝破坏和增生 / 异型增生四个方面进行评估，每项 0-4 分，计算累积炎症指数。​

（四）炎症因子检测​

1. 组织匀浆制备：取降结肠组织，称重后加入 Hank’s 平衡盐溶液（含蛋白酶抑制剂鸡尾酒），用组织匀浆器制成匀浆，4°C 离心 10 分钟，收集上清液。​

1. 蛋白定量：使用 Bradford 法测定蛋白浓度，调整各组样本蛋白浓度一致。​

1. ELISA 检测：按照试剂盒说明书操作，检测白细胞介素 - 12（IL-12）和前列腺素 E₂（PGE₂）的含量，检测限分别为 15pg/mL 和 8pg/mL。​

（五）基因与蛋白表达分析​

1. RNA 提取与 RT-PCR：使用 TRI 试剂提取结肠组织总 RNA，逆转录合成 cDNA。以 β-actin 为内参，设计 TLR4 特异性引物（上游：5’-atgccagagcggctgctcag-3’，下游：5’-gattgtggtatccactgtagc-3’），进行 PCR 扩增，产物经 1.3% 琼脂糖凝胶电泳，用 Scion Image 软件分析条带强度。​

1. Western blot：提取组织总蛋白，进行 SDS-PAGE 电泳，转膜后用 5% 脱脂奶粉封闭 1 小时，加入 TLR4 抗体（1:1000）和 β-actin 抗体（1:5000），4°C 孵育过夜，次日加入 HRP 标记的二抗（1:5000），室温孵育 1 小时，ECL 显色，凝胶成像系统拍照分析。​

（六）肠移植实验​

1. 胚胎取材：取胚胎第 14.5 天（E14.5）的 Crh⁺/⁺和 Crh⁻/⁻小鼠肠道组织，修剪成小块。​

1. 移植操作：将两种胚胎肠道组织分别移植到 SCID 小鼠背部皮下，术后饲养 12 周，待移植肠段发育形成完整肠腔。​

1. LPS 刺激：腹腔注射 LPS（100μg / 只）或生理盐水，4 小时后取材，检测肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）的基因表达，评估 TLR4 信号通路的功能。​

四、实验结果：CRF 缺失引发的连锁反应​

（一）CRF 缺失加剧 DSS 诱导的结肠炎​

在 DSS 处理 7 天后，Crh⁻/⁻小鼠的体重下降幅度显著大于 Crh⁺/⁺小鼠，DAI 评分更高，表现出更严重的腹泻和血便。组织学分析显示，Crh⁻/⁻小鼠结肠黏膜出现广泛的上皮破坏、隐窝缺失和大量炎症细胞浸润，累积炎症指数较野生型小鼠升高 50%（图 1A-C）。ELISA 结果表明，Crh⁻/⁻小鼠结肠组织中 IL-12 和 PGE₂的含量分别增加了 30% 和 40%，证实促炎因子的过度表达与 CRF 缺失密切相关。​

（二）CRF 调控 TLR4 表达独立于糖皮质激素​

RT-PCR 和 Western blot 结果显示，在基础状态下，Crh⁻/⁻小鼠结肠组织中 TLR4 的 mRNA 和蛋白表达水平较 Crh⁺/⁺小鼠降低约 40%（图 2A-B）。值得注意的是，DSS 诱导后，两组小鼠 TLR4 表达均有升高，但 Crh⁻/⁻小鼠的诱导水平仍显著低于野生型。肠移植实验进一步证实，在相同的宿主环境（糖皮质激素水平正常）下，Crh⁻/⁻移植肠段在 LPS 刺激后 TNF-α 的表达量比 Crh⁺/⁺肠段低 35%（图 2C），表明 CRF 直接调控肠道 TLR4 的表达，而非通过糖皮质激素间接作用。​

（三）糖皮质激素补充无法逆转 CRH 缺失的影响​

为排除糖皮质激素不足的干扰，研究人员在 DSS 处理期间给 Crh⁻/⁻小鼠补充 corticosterone（10μg/mL 饮用水）。然而，组织学评分和炎症因子检测显示，补充糖皮质激素并未减轻 Crh⁻/⁻小鼠的结肠炎症，累积炎症指数和 IL-12 水平与未补充组无显著差异（图 3A-B）。生存实验中，Crh⁻/⁻小鼠在 DSS 处理后死亡率高达 100%，而 Crh⁺/⁺小鼠全部存活，进一步表明 CRF 的保护作用独立于糖皮质激素。​

（四）CRF 影响结肠炎的修复过程​

在 DSS 处理停止后的恢复期，Crh⁺/⁺小鼠体重逐渐恢复，结肠黏膜上皮再生，隐窝结构重建；而 Crh⁻/⁻小鼠体重持续下降，组织学显示炎症持续存在，上皮修复失败（图 4C）。Western blot 检测发现，Crh⁻/⁻小鼠结肠组织中磷酸化 p38 MAPK 的表达水平在恢复期显著升高，提示 MAPK 信号通路的持续激活可能是炎症无法消退的重要机制。​

五、机制解析：CRF-TLR4 轴的双重守护​

（一）CRF 作为 TLR4 的上游调控因子​

在正常肠道中，CRF 通过激活细胞内的信号通路，促进 TLR4 基因的转录和蛋白表达。TLR4 作为 LPS 的受体，识别肠道共生菌或病原体，启动先天免疫应答，维持肠道屏障功能。当 CRF 缺失时，TLR4 表达下调，导致肠道上皮细胞和免疫细胞对病原体的识别能力下降，屏障功能减弱，细菌易位增加，从而加剧结肠炎。​

（二）独立于糖皮质激素的免疫调节​

尽管 Crh⁻/⁻小鼠存在糖皮质激素不足，但补充糖皮质激素并不能改善其结肠炎表型，说明 CRF 在肠道免疫调节中具有独特的作用。这种作用可能通过直接影响 TLR4/MyD88 信号通路，调节促炎因子的产生和炎症细胞的浸润，而非依赖于糖皮质激素的抗炎效应。​

（三）对结肠炎恢复期的关键影响​

在炎症消退阶段，CRF 可能参与调控 MAPK 等信号通路，促进上皮细胞修复和组织再生。CRF 缺失导致 p38 MAPK 持续激活，炎症反应无法及时终止，最终导致慢性炎症和组织损伤。