无标记生物传感器阵列新进展

无标记亲和生物传感器阵列：分子诊断的新技术

1. 引言

酶联免疫吸附测定（ELISA）作为体外蛋白诊断的核心技术已有40多年的历史，在医疗保健领域中，对于临床样本中疾病生物标志物的检测和定量仍然至关重要[1]。然而，随着个性化和分层医疗的发展，对多重、高通量诊断的内在需求日益增长，同时即时检测的发展也对易用性和低成本提出了要求，这些因素正在改变现有格局。实现这些新兴趋势亟需创新的诊断设备。

无标记亲和生物传感器被广泛认为是解决这些挑战的技术方案。这些分析装置包含一种高度特异性和高亲和力的探针分子，最常见的是抗体，该分子被固定在物理化学换能器的表面。换能器直接监测任何结合事件，即无需额外的抗体、酶、荧光或放射性标记，也无需其他放大方法，即可提供与结合分子浓度成正比的响应信号。这类生物传感器中可能最为人熟知的是用于监测抗原‐抗体相互作用的表面等离子体共振（SPR）传感器[2]。SPR利用表面等离子体对金属表面附近折射率变化的高度灵敏性，导致共振角或波长发生变化。例如，当抗原与固定在金属表面的抗体结合时引起的局部折射率变化，便可通过共振的相应偏移实现实时且无标记的检测。如今，SPR已成为一项成熟的生物物理技术，支撑着生物和生物医学科学领域的基础研究。然而，由于仪器和传感器成本较高，SPR在临床诊断中的应用却很少。因此，当前的生物传感器研究重点集中在开发替代技术，以在易于使用、低成本且适用于临床、即时检测甚至家庭使用的平台上实现高灵敏度和选择性蛋白质检测。

创新性的生物传感器研究蓬勃发展；2015年标题中含有“biosensor”的文章发表数量达到2898篇，而2000年仅为504篇（数据来自科学引文索引（Web of Science））。迄今为止，大部分研究集中于开发以及换能器材料的优化，最近尤其关注碳基生物传感器[3,4]，和物理化学转导策略，其中对能够响应生物分子光学、电化学和机械性能的换能器最受关注。已发表多篇关于生物传感器转导策略的综合性综述文章[5‐7]。此外，还有大量研究致力于优化用于抗体固定的表面化学，以及开发替代性的高亲和力结合剂，如抗体片段、DNA、肽适配体和分子印迹聚合物[8]。本社论概述了生物传感器研究的两大主要趋势，即向高密度生物传感器阵列发展以及多模态生物传感器技术的开发。

2. 用于多重诊断的高密度生物传感器阵列的制造

对健康和疾病状态下复杂生物过程的全面理解，需要在单次检测中实现对分子表达谱的高通量定量。这种用于蛋白质监测的多重检测方法不仅对基础生物医学研究至关重要，而且是个性化医疗策略以及新型疾病生物标志物发现的基础。在小体积临床样本中同时检测数十、数百甚至数千种蛋白质种类是一项重大的技术挑战，亟需新的技术解决方案。为此，许多类型的光子和电化学生物传感器已采用半导体产业开发的低成本、高产量且高精度的大规模制造技术，能够制造出具有亚微米尺寸的生物传感器，非常适合高密度集成。然而，将不同探针分子固定到每个传感器所需的生化功能化技术尚未达到同等水平的集成能力。例如，用于构建抗体阵列的点印制方法目前的空间分辨率仅限于约0.1 mm。尽管这些打印技术的分辨率有望进一步提升，但针对可处理极小样本体积的高密度生物传感器阵列所需的特征尺寸仍可能超出此类系统的实现范围。虽然高空间分辨率分子固定化已在实验室，例如使用纳米刻写[9]或蘸笔纳米光刻[10]，这些串行方法无法提供大规模制造高密度蛋白质阵列所需的高通量。

电化学控制功能化是一种有前景的空间定向生物分子固定化方法，可同时满足分辨率、速度要求，并能在阵列中的每个生物传感器上涂覆不同的探针分子。例如，通过电化学裂解金‐硫键，已实现将不同蛋白质定向固定在相距15微米的20微米直径金属电极上[11]。随后利用该电极微阵列，在全细胞裂解物中实现了对周期蛋白依赖性蛋白激酶的无标记电子检测，且功能化电极之间无明显串扰。类似的空间分辨率（1微米）也通过重氮盐在导电表面的电化学接枝得以实现[12]。重氮盐的使用适用于多种导电表面，包括硅，并已被用于构建一种无标记硅光学生物传感器阵列，具有实现高度多重分子检测的潜力[13]。这些研究展示了电化学导向方法在位点选择性功能化方面的巨大潜力。未来的研究将确定可达到的最终空间分辨率，探索高密度阵列功能化的速度、特异性和效率极限，以及是否足以实现可用于商业化的规模化生产。

3. 多模态，无标记生物传感器

现有的大多数无标记生物传感器均为单模式；检测由对单一物理化学性质敏感的换能器提供。例如，在表面等离子体共振中，通过测量相应的折射率变化来检测抗体‐抗原复合物的形成，而电容式生物传感器则通过抗原结合后检测抗体层阻抗的变化来实现检测。结合多种 transduction 机制的生物传感器正在成为越来越受欢迎。这种真正的多模态检测可同时探测多种生物分子特性，例如在光学、电子和/或化学领域，以提供更深入的洞察并扩大可分析系统的范围。此类多模态生物传感的一个典型例子是电化学SPR（EC‐SPR），其中支持光学模式的金表面也用作电化学池中的工作电极。电化学和光学两个领域的互补信息不仅提供了对表面发生的生物分子过程更深入的理解，而且还被用于提高生物传感器准确性。例如，已报道一种基于EC‐SPR的葡萄糖生物传感器，通过结合同时进行的电化学和光学测量，区分葡萄糖氧化酶的酶活性与非酶促反应的背景干扰[14]。此外，使用结合了电化学测量和石英晶体微天平（QCM）的多模态生物传感器也报道了关于酶活性的新见解，QCM对固定化分子层的质量和粘弹性变化均敏感[15]。

理想情况下，人们希望结合两者的优点，即在微小表面积上集成大量传感器阵列，能够对小样本体积中的生物标志物含量进行分析，同时每个传感区域可执行多种类型的检测。迄今为止，这仍无法实现：现有的微阵列可并行进行多项测试，但由于其宏观尺寸，需要相对较大的样本体积；表面等离子体共振（SPR）和石英晶体微天平检测（QCMD）虽能实现多模态分析，但仅限于单个或极少数检测位点。我们认为，实现真正多模态多重检测的途径在于硅技术。为此，电光硅生物传感器将光学和电化学检测集成于单一的微加工生物传感器阵列中。通过调控硅光子微环谐振器的掺杂浓度分布，使掺杂剂位于硅表面的薄层中，从而实现了在硅材料中结合电化学与光学检测的能力。该掺杂表面层可被优化至具有足够导电性以支持电化学过程，同时足够薄以最大限度减少光学损耗谐振结构内的光学模式。同一平台还可用于电化学引导探针分子的固定化，从而实现多模态和高通量多重检测。

4. 结论与展望

医疗保健方式的变革需要新一代诊断技术，能够同时检测大量蛋白质，具有高灵敏度和选择性，并且在一个简单、廉价且便携的平台上实现，从而可在诊所、即时检测点甚至家庭中进行检测。无标记亲和生物传感器是一种新兴技术，有望满足这些需求，尤其是在利用硅微电子工业的技术进步方面已取得显著进展。尽管将这种新型诊断技术及相关生物标志物转化为临床实践仍面临诸多技术、科学和监管挑战，但其在改变医疗保健实践和改善患者预后方面的潜力巨大。