哺乳动物重组蛋白表达｜HEK293/CHO细胞蛋白表达服务｜哺乳表达

一、服务概述

哺乳动物细胞蛋白表达作为重组蛋白生产的关键技术，在生物医药领域具有不可替代的地位。与大肠杆菌蛋白表达相比，其最大优势在于能够实现复杂翻译后修饰，生产具有完整生物活性的治疗性蛋白。HEK293蛋白表达系统和CHO细胞表达系统是目前最常用的两大平台，分别适用于不同规模的生产需求。

1. 载体构建

常用的哺乳表达载体包含CMV或EF-1α等强启动子，能有效驱动蛋白表达。为方便后续的纯化操作，通常会再添加6xHis、FLAG等亲和标签。如果需要分泌表达，还要加入合适的信号肽序列，如Igκ轻链信号肽就是常用的选择。

2. 细胞培养

HEK293和CHO细胞是最常用的宿主细胞，培养时可采用含血清培养基或无血清培养基。培养方式主要有贴壁培养和悬浮培养两种，其中悬浮培养更适用于工业放大生产。

3. 细胞转染

细胞转染即将构建好的载体导入细胞。常用的转染方法有：①脂质体转染操作简便，适合小规模实验；②PEI转染性价比高，适合中等规模；③电转染适合难转染的细胞。

4. 蛋白表达

一般情况下，细胞转染后48-72小时即可收获蛋白。对于难表达的蛋白，可以尝试低温培养，例如30-33℃。

5. 蛋白收获

分泌表达的蛋白可直接收集培养上清，通过离心去除细胞碎片即可。如果是胞内表达的蛋白，则需要裂解细胞释放目的蛋白，必要时可借助超声破碎。

6. 蛋白纯化

纯化方法可根据前期设计的标签进行选择，His标签蛋白常用镍柱亲和纯化，抗体则多用Protein A/G纯化。为进一步提高纯度，可增加离子交换层析或分子筛层析等步骤。

7. 质量检测

表达成功的蛋白，通过SDS-PAGE检测纯度和分子量，Western blot验证特异性。另外，根据需要还可以进行糖基化分析和生物活性检测等更严格的质控。

二、常见问题（FAQ）

Q1：哺乳动物表达系统最适合表达哪些类型的蛋白？
A：哺乳动物表达系统特别适合需要复杂翻译后修饰的蛋白质，如糖基化蛋白、分泌型蛋白和跨膜蛋白等。这类系统能够提供最接近天然的人类蛋白质修饰模式。

Q2：HEK293和CHO细胞系应该如何选择？
A：选择主要取决于实验目的。HEK293细胞转染效率高，适合快速小规模表达；CHO细胞则更适合需要长期稳定表达和大规模生产。

Q3：影响哺乳动物蛋白表达量的关键因素有哪些？
A：主要影响因素包括：载体启动子强度、基因序列优化程度、转染效率、细胞培养条件和诱导表达参数等。需要系统优化各个环节才能获得理想表达量。

Q4：瞬时表达和稳定表达各有什么优缺点？
A：瞬时表达周期短（1-2周），适合快速获取蛋白质；稳定表达需要较长时间建立（4-8周），但表达更稳定持久。

Q5：如何提高表达蛋白的可溶性和生物活性？
A：可尝试优化表达温度（如30-33℃）、添加分子伴侣、调整培养时间等。对于特别难表达的蛋白，可能需要尝试不同的表达系统和优化策略。