10、蓝藻生物钟机制探秘

蓝藻生物钟机制探秘

1. 体外重构系统的建立

在生物钟研究领域，一直存在一个疑问：除了转录 - 翻译反馈环路（TTFL），是否还有其他振荡机制？研究发现，在过量利福平存在的光照条件下，产生KaiC磷酸化节律的细胞，即使洗去抑制剂也无法繁殖，这意味着细胞可能已经死亡，或者不可逆地越过了可繁殖的临界点，同时也表明生物钟振荡甚至可以在死亡（或“幽灵”）细胞中维持。显然，Kai蛋白的生物化学特性是核心，但其他细胞功能，如时钟蛋白的亚细胞定位，或Kai蛋白与DNA或其他蛋白质的相互作用，尚未被排除。

为了探索这个问题，研究人员采取了多种方向。一方面，计划采用标准生物化学方法，使用部分破坏的细胞、粗提物或蓝藻细胞的亚细胞分级分离物来观察酶活性（即KaiC磷酸化节律）。另一方面，有人提出将KaiA、KaiB和KaiC混合，看看是否能产生节律，并让Masato负责。这个想法最初只是个玩笑，因为从重组蛋白开始获得节律听起来过于乐观。但研究已经到了一个阶段，认为即使不能得到节律，也可能发现一些有趣的蛋白质动态。

Masato具有蛋白质生物化学背景，显著提高了纯化Kai蛋白的质量。他开始重构实验，固定KaiA的量，以各种方式改变KaiB和KaiC的浓度。虽然有时观察到KaiC磷酸化的短暂增加，但没有看到任何周期性波动。之后，Masato请Taeko Nishiwaki和Keiko Imai测试更多实验条件。

2004年11月1日傍晚，Masato兴奋地表示可能看到了某种节律。在Taeko和Keiko Imai增加KaiA浓度后取样的SDS - PAGE凝胶上，经过考马斯亮蓝（CBB）染色后正在脱色。Taeko当时已经回家，当大家仔细观察凝胶时，确实看到磷酸化条带在周期性变化。Tae