Proseg工具在MERSCOPE数据中的优化实践与问题解析

Proseg工具在MERSCOPE数据中的优化实践与问题解析

概述

Proseg是一款用于空间转录组数据分析的细胞分割工具，特别适用于MERSCOPE平台生成的数据。本文将从技术角度深入探讨Proseg在MERSCOPE数据处理中的实际应用经验，包括参数优化策略、常见问题分析以及解决方案。

Proseg默认配置解析

Proseg提供了--merscope预设参数，但需要注意的是，当前版本中这个预设主要作用是告诉工具输入文件的格式，而非针对MERSCOPE平台进行特定的参数优化。开发者明确表示，未来可能会根据平台特性进行更细致的参数调整。

关键可调参数详解

在实际应用中，以下几个参数对结果影响较大，值得重点关注：

1. 转录本重定位参数

   • --diffusion-probability：控制被重定位转录本的比例，数值越大允许更多转录本被重新定位
   • --diffusion-sigma-far：决定转录本可以被移动的最大距离，增大此值允许转录本移动更远

2. 体素大小与采样计划

   • --initial-voxel-size：以微米为单位的初始体素大小
   • --schedule：迭代次数设置，可以是单一数值或逗号分隔的列表，表示在不同轮次中体素大小减半

3. 先验分割参数

   • --nuclear-reassignment-prob：调整该值可以控制结果与初始核分割的吻合程度，降低此值会强制结果更符合初始核分割

常见问题与解决方案

细胞分割碎片化问题

在实际应用中，用户经常遇到单个细胞被分割成多个小片段的问题。经过深入分析，这通常源于以下原因：

1. 初始核分割质量不佳：Proseg的算法设计使其高度依赖初始核分割结果。如果初始分割存在过度分割(oversegmentation)问题，Proseg无法通过后续处理合并这些分割片段，只能尝试优化边界。

2. 转录本数量不足：在转录本密度较低的区域，算法可能难以准确识别完整细胞边界，导致分割结果出现异常"突起"或碎片化。

解决方案：

• 手动运行Cellpose等专业核分割工具对核染色图像进行预处理，获取更准确的初始分割
• 适当调整--nuclear-reassignment-prob参数，平衡初始分割与转录本空间分布信息

可视化兼容性问题

将Proseg生成的结果与MERSCOPE可视化工具集成时，需要注意：

1. ID匹配问题：Proseg会生成新的细胞ID(通常使用行号)，这与原始MERSCOPE分析的ID系统不兼容。这会导致在可视化工具中显示的细胞-基因矩阵数值不准确。

2. 文件格式转换：虽然可以使用Vizgen的VPT工具将Proseg的.geojson输出转换为.parquet格式，但在Windows系统上可能会遇到兼容性问题。

最佳实践建议

1. 质量控制：在正式分析前，务必检查初始核分割的质量。良好的初始分割是获得准确结果的基础。

2. 参数调优：建议从小范围测试开始，逐步调整关键参数，观察对结果的影响。特别注意--diffusion系列参数对转录本分布的影响。

3. 下游分析：进行下游分析时，建议直接使用Proseg生成的细胞-基因矩阵(expected_counts.csv或maxpost_counts.csv)和细胞元数据，而非通过VPT工具二次处理的结果，以确保数据一致性。

4. 可视化验证：虽然可视化工具存在ID匹配问题，但仍可用于定性评估分割结果的形态学合理性。定量分析则应依赖Proseg的直接输出。

总结

Proseg作为一款专业的空间转录组分析工具，在MERSCOPE数据处理中展现出良好的应用潜力。通过理解其工作原理、合理调整参数，并注意初始分割质量，研究人员可以获得更准确的细胞分割结果。未来随着工具的持续发展，期待看到更多针对特定平台的优化和自动化功能。