生信分析基本流程--单样本分析

已于 2023-09-29 21:57:09 修改
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文章标签： 笔记 r语言 经验分享 学习方法
于 2023-09-29 21:51:15 首次发布
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最近在学单细胞的生信分析，学的有点懵。。。。先做点记录吧，后面在看看有什么要改的。

说起来，生信分析的B站上怎么全是直到这基本流程就结束的。。看文献后面应该还有很多。。不知道怎么学了。

建议：每步处理完之后都建议：

saveRDS(SZDX0224_val, file = "./Data/SZDX-0224_outs/SZDX0224_val.rds")

方便后面可以随时检查：

SZDX0224_val <- readRDS(file = "./Data/SZDX-0224_outs/SZDX0224_val.rds")

本文章结构：核心代码、部分函数解释、结果图

1、R包加载和安装

if(!require(multtest))BiocManager::install("multtest")
if(!require(Seurat))install.packages("Seurat")
if(!require(dplyr))install.packages("dplyr")
if(!require(patchwork))install.packages("patchwork")
if(!require(R.utils))install.packages("R.utils")
rm(list = ls());gc()        #删除所有环境变量整理内存空间

2、数据读取

# 构建数据文件夹的相对路径
relative_path <- file.path(base_path, "Data", "SZDX-0224_report", "SZDX-4-0224 starsolo", "SZDX-4-0224", "filtered")
# 自动读取10X的数据，是一些tsv与mtx文件。
SZDX0224 <- Read10X(relative_path)
# 单细胞的分析一般都是利用Seurat包来实现的，所以我们也要转成Seurat的对象
SZDX0224_project <- CreateSeuratObject(counts = SZDX0224, project = "SZDX0224", min.cells = 0, min.features = 200)

在这里，我们使用的是自己的一个数据SZDX0224，用的是10x得到的。

其中CreatSeuratObject函数的参数：

CreateSeuratObject(counts = NULL, project = NULL, min.cells = 3, min.features = 200, sep = "_", group.by = NULL, block.by = NULL, merge.data = TRUE, do.normalize = TRUE, do.scale = TRUE, gene.column = 1, sample.names = NULL, expression.family = NegBinomial, nUMI = NULL, local.only = FALSE)
  • counts（必需）：一个矩阵或数据框，其中包含单细胞RNA测序的原始计数数据，行代表基因，列代表细胞/Barcode。矩阵里的数值就是对应的，含有该基因的细胞数（我们做实验都会有很多细胞）
  • project（可选）：一个字符串，表示你所使用的Seurat对象的名称或项目名称。在这里就是前面Read10x赋值的变量名。
  • min.cells（可选）：一个整数，指定一个细胞必须具有的最小基因数，否则将被排除在分析之外。(一个细胞有多个基因，根据实际情况，可修改设置进行过滤)
  • min.feature（可选）：一个整数，指定一个细胞必须具有的最小UMI（Unique Molecular Identifiers）数，否则将被排除在分析之外。（最小UMI数：UMI是每个转录RNA的身份证，进行PCR时，每次扩增（转录）生成的UMI都不同，也就是身份证号码不同。如何计算UMI数？扩增的时候，Barcode是不会变的，也就是你国籍不会变，但人多了。所以相同Barcode/国籍，但UMI/身份证不同就能进行计数）
  • 其他的参数哦那个的比较少，可自行了解

Read10得到的，一般不关注这个：

i是矩阵中非0值的行索引，p是矩阵中非0值的列索引，所以i、p就是非0值的行坐标和列坐标。Dim是矩阵维度。Dimnames就是这个矩阵的行名（基因名）和列名（细胞名），Dimnames[[1]] 包含基因名称，Dimnames[[2]] 包含细胞名称。x是一个稀疏矩阵，里面的就是矩阵里的值。factors包含了与数据矩阵中的列相关的因子或分组信息。这些因子通常表示不同的样本、细胞类型、批次等，在这里就没保存什么信息。

转成的Seurat对象SZDX0224_project：

初步查看Seurat对象SZDX0224_project：

36601个基因，728个细胞

获取细胞数：

ncol(SZDX0224_project)和ncol(SZDX0224)均可

3、计算线粒体基因占比

计算线粒体基因占比的原因：当线粒体的RNA含量过高的时候，可能意味着细胞的细胞核不太活跃，也就是正常的胞质RNA含量下降。就有两种情况：1、细胞活性不太好，需要过滤掉  2、细胞本身线粒体含量比较高。在这里，percent就是这个Barcode里检测到的RNA，有百分之percent的是线粒体的RNA（percent的单位是%）

SZDX0224_project[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(SZDX0224_project, pattern = "^MT-") 




#### 查看效果 ####
# 以条形图的形式展示线粒体基因的占比与对应的数量
hist(SZDX0224_project[["percent.mt"]]$percent.mt)

# 人源的数据为MT，鼠源的需要换成mt，选取前5个
head(SZDX0224_project@meta.data,5)

# 以小提琴图的形式展示测序的细胞情况
VlnPlot(SZDX0224_project, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3) # ncol是每行展示多少张图

# 以散点图的形式表示 
plot1 <- FeatureScatter(SZDX0224_project, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(SZDX0224_project, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
if(!require(patchwork))install.packages("patchwork")
CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))

PercentageFeatureSet函数：

PercentageFeatureSet(object, features = NULL, pattern = NULL, slot = "RNAcounts", subset = NULL)
  • object（必需）：一个Seurat对象，包含了单细胞RNA测序数据。
  • features（可选）：一个字符向量，包含要计算百分比的基因名称。如果想知道部分基因的情况，可直接输入features = c("基因名1", "基因名2", "基因名3", "基因名4", "基因名5")
  • pattern（可选）：一个字符，用于筛选具有匹配模式的基因名称。在这里我们使用了^MT-，这代表人的线粒体基因。一般来说，features和pattern这两个参数选一个就行

经过查找后，SZDX0224_project的meta.data发生了变化：

条形图查看线粒体基因占比：

小提琴图：

散点图：

每个点都是一个细胞，nFeature_RNA指每个细胞中检测到的基因的数目，nCount_RNA是代表的是每个细胞识别到的RNA的数量即UMI（每个基因都会检测到好几条RNA）。对于第一张图，当检测到的RNA数量很少，但线粒体的占比很高（越偏向左上角），说明那个细胞很可能是死亡的。

可以看出我们的细胞质量还是比较好的

4、过滤不合格的数据

SZDX0224_val <- subset(SZDX0224_project, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7000 & percent.mt < 20)

subset函数：

subset(object, subset, ...)
  • object（必需）：一个Seurat对象，包含了单细胞RNA测序数据和其他相关信息。
  • subset（必需）：一个逻辑表达式，用于指定提取细胞子集的条件。只有满足条件的细胞将被包含在子集中。
  • ...：其他参数通常不需要使用

可以看到有5个细胞被过滤了出去，4代表着现在meta.data有四个数据

5、标准化

归一化的目的是消除不同样本之间的技术差异和批次效应，以及使得不同细胞之间的表达值在数量级上可比较。

SZDX0224_val <- NormalizeData(SZDX0224_val, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)  # 归一化到10000
SZDX0224_val <- FindVariableFeatures(SZDX0224_val, selection.method = "vst", nGenes = 2000)        # 寻找2000个显著变异的基因特征
SZDX0224_val <- ScaleData(SZDX0224_val, vars.to.regress = c("percent.mt"))  # vars.to.regress是去除线粒体基因的占比

NormalizDatah函数：

NormalizeData(object, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000, do.scale = TRUE, genes.use = NULL)
  • object（必需）：一个Seurat对象，包含了原始的单细胞RNA测序数据。
  • normalization.method（可选）：一个字符，指定归一化方法。常用的方法包括："LogNormalize"（默认值）：对数据进行对数变换，以稳定方差，并将数据缩放到一个常数（默认是 10,000）。 "CLR"：进行中心对数比例（Centered Log Ratio）变换。 "SCT"：使用SCTransform方法进行归一化。
  • scale.factor（可选）：一个数值，用于确定归一化后的数据的缩放因子。默认值是 10,000。
  • do.scale（可选）：一个逻辑值，指示是否对数据进行缩放。如果为TRUE（默认值），则进行缩放。
  • genes.use（可选）：一个字符向量，包含要用于归一化的基因名称。如果未指定，将对所有基因进行归一化

FindVariableFeatures函数：

FindVariableFeatures(object, selection.method = "vst", nfeatures = NULL, min.mean = 0.0125, max.mean = 3, min.disp = 0.5)
  • object（必需）：一个Seurat对象，包含了原始的单细胞RNA测序数据。
  • selection.method（可选）：一个字符，指定用于选择变异特征的方法。常用的方法包括："vst"（默认值）：使用Variance Stabilizing Transformation（VST）方法。 "dispersion"：使用基于离散度的方法。 "mean.var.plot"：使用平均方差图。
  • nfeatures（可选）/和nGene是等效的：一个整数，指定要选择的变异特征的数量。如果未指定，函数将选择符合其他条件的特征。
  • 其他参数一般默认值即可

ScaleData函数：

ScaleData(object, features = NULL, vars.to.regress = NULL, model.use = "vars.to.regress", do.scale = TRUE, do.center = TRUE, block.size = 2000)
  • object（必需）：一个Seurat对象，包含了原始的单细胞RNA测序数据。
  • vars.to.regress（可选）：一个字符向量，包含要在标准化中移除的技术变量的名称。这些变量通常表示不感兴趣的技术效应，如细胞计数或批次效应。
  • 其他参数一般默认值即可

标准化后的SZDX0224_val：

6、PCA降维/线性降维/主成分分析

一般是直接分析高变基因

SZDX0224_val <- RunPCA(SZDX0224_val, features = VariableFeatures(object = SZDX0224_val))  # 线性降维



# 以点图的形式展示前两个维度    意义不大
VizDimLoadings(SZDX0224_val, dims = 1:2, reduction = "pca") 
# 获得主成分的散点图，根据此图可选取需要多少个主成分进行降维
ElbowPlot(SZDX0224_val, ndims = 50)   # 根据这里的图，可以看到大概选取15个主成分就够了
# 热图形式判断选哪些主成分    这个意义不大
DimHeatmap(SZDX0224_val, dims = 1:20, cells = 500, balanced = T)
# 同样是用于选取主成分
SZDX0224_val <- JackStraw(SZDX0224_val, num.replicate = 100)
SZDX0224_val <- ScoreJackStraw(SZDX0224_val, dims = 1:20)
JackStrawPlot(SZDX0224_val, dims = 1:20)

RunPCA函数：

RunPCA(object, features = NULL, npcs = 50, ndims.print = 10, subset.row = NULL, do.print = FALSE, pcs.print = 1:5, seed.use = NULL)
  • object（必需）：一个Seurat对象，包含了单细胞RNA测序数据。
  • features（可选）：一个字符向量，包含要用于PCA分析的特征（通常是基因）的名称。如果未指定，将对所有特征进行PCA分析。
  • 其他参数默认即可

散点图：

这里得到的是每个主成分的里，基因之间的差异，一般选择主成分的方式就看哪个点开始变平滑。

7、非线性降维+聚类

SZDX0224_val <- FindNeighbors(SZDX0224_val, dims = 1:15)
SZDX0224_val <- FindClusters(SZDX0224_val, resolution = 0.6)  # 想聚类分得更细（分群分的更细），可以换更大的值，比如1.2等，一般先分一个粗一点的分群
SZDX0224_val <- RunUMAP(SZDX0224_val, dims = 1:15)  # 非线性降维
SZDX0224_val <- RunTSNE(SZDX0224_val, dims = 1:15)


#### 查看聚类效果
DimPlot(SZDX0224_val, reduction = "umap", label = T)
DimPlot(SZDX0224_val, reduction = "tsne", label = T)

这里就不详细解释每个函数了，基本就使用这几个参数，其他保持默认。

tsne图：

之后SZDX0224_val的结果：

8、去除多包液滴

不可避免会出现多包的情况，这里用DoubletFinder去除

具体怎么个去除法。。。不是很懂，只知道这样就能去除多包的细胞

devtools::install_github('chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder')
library(DoubletFinder)
saveRDS(SZDX0224_val, file = "./Data/SZDX-0224_outs/SZDX0224.rds")
readRDS(SZDX0224_val, file = "./Data/SZDX-0224_outs/SZDX0224_val.rds")
SZDX0224_val_db <- SZDX0224_val
# 寻找最优pK值
sweep.res.list_SZDX0224_val <- paramSweep_v3(SZDX0224_val_db,PCs = 1:30, sct = F)
sweep.stats_SZDX0224_val <- summarizeSweep(sweep.res.list_SZDX0224_val, GT = F)
bcmvn_SZDX0224_val <- find.pK(sweep.stats_SZDX0224_val)
pK_value<-as.numeric(as.vector(bcmvn_SZDX0224_val$pK[which.max(bcmvn_SZDX0224_val$BCmetric)]))  # 最佳pK值
# 双细胞比例计算
annotations <- SZDX0224_val@meta.data$seurat_clusters
homotypic.prop <- modelHomotypic(annotations) # 同类细胞的比例  
DoubletRate <- 0.004  # 查表
nExp_poi <-round(DoubletRate*length(SZDX0224_val$seurat_clusters))   # 最好提供celltype，而不是seurat_clusters。
nExp_poi.adj <- round(nExp_poi*(1-homotypic.prop))  # 矫正
# 设置pN和pANN_value（这个一般是F）
pN_value <- 0.25
pANN_value <- paste0("pANN_", pN_value, "_", pK_value, "_", nExp_poi)
# 两种方法计算多包，看哪种效果好就行，一般是第二个
# SZDX0224_val_db <- doubletFinder_v3(SZDX0224_val, PCs = 1:30, pN = pN_value, pK = pK_value, nExp = nExp_poi, reuse.pANN = F)
SZDX0224_val_db <- doubletFinder_v3(SZDX0224_val, PCs = 1:30, pN = pN_value, pK = pK_value, nExp = nExp_poi.adj, reuse.pANN = F)
SZDX0224_val_db@meta.data[1:5, ]
SZDX0224_val$doublets <- SZDX0224_val_db$DF.classifications_0.25_0.29_3   # 根据上面那行代码的结果的最后一列，严谨点就是前一列



#### 绘制tsne查看效果
DimPlot(SZDX0224_val, reduction = "tsne", group.by = "doublets")
DimPlot(SZDX0224_val, reduction = "tsne", group.by = "seurat_clusters", label = T)

里面的多包率DoubletRate根据以下表来查（这里是10x的）：

挑出来的多包细胞：

9、高表达或特异表达基因

SZDX0224.markers <- FindAllMarkers(SZDX0224_val, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)
# 保存marker
write.csv(SZDX0224.markers, './Data/SZDX-0224_outs/SZDX0224.markers.csv')
# 获取每个分群的高表达的基因里前两个基因的数据（包括基因名称等）
SZDX0224.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_log2FC)

# 在知道样本的情况下，即知道有哪些群（哪些细胞），根据它有的基因，查看它在哪个群
# 以下都是以下高表达基因在每个群的效果图
# features就是你知道的某个细胞的所拥有的基因
# tsne图展示
FeaturePlot(SZDX0224_val, features = c("HIST2H2AC", "HIST1H3B", "NEAT1", "MIR924HG", "BCLAF1", "HIST1H2BO", "MT-CO1", "MT-ND5"), reduction = "tsne", label = T)

# 小提琴图的形式展示某基因在这个样本里的分群情况（小提琴图的形式看它在哪个群）
VlnPlot(SZDX0224_val, features = c("HIST2H2AC", "HIST1H3B", "NEAT1", "MIR924HG", "BCLAF1", "HIST1H2BO", "MT-CO1", "MT-ND5"), pt.size = 0)

# 以热图的形式展示每个分群的高表达基因里前 10 的的基因的表达情况
top10 <- SZDX0224.markers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_log2FC)
DoHeatmap(SZDX0224_val, features = top10$gene, label = F, slot = "scale.data")

FindAllMarkers函数：only.pos = TRUE表示只显示高表达的基因，min.pct = 0.25表示在细胞中的比例最少为25%，logfc.threshold = 0.25差异表达基因的最小对数折叠变化（log-fold change）。

以下是每个分群里的高表达基因

以下是各个高变基因的tsne图，颜色越深，表示表达程度越高

# 如果想要某个分群与其他某个分群对比，可按照以下代码运行
marker <- FindMarkers(SZDX0224_val, ident.1 = "0", ident.2 = "1", only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.25)

在这里ident.1 = "0"和ident.2 = "1"表示0群和1群。其他的和FindAllMarkers函数一样。

p_val用于衡量基因的差异表达程度，越小表示在不同的细胞群之间的表达差异越显著。p_val_adj则是经过校正后的p_val。一般用p_val_adj。

pct.1和pct.2分别是基因在对应分群的表达率。

10、细胞类型标注(就是将原来的数字改为对应的细胞名)

new.cluster.ids <- c("细胞名0", "细胞名1", "细胞名2", "细胞名3")  # 细胞类型标注向量
names(new.cluster.ids) <- levels(SZDX0224_val)                    # 将创建的新细胞簇名称列表的每个元素与原始数据中的细胞簇名称（0、1、2、3）相匹配
SZDX0224_val <- RenameIdents(SZDX0224_val, new.cluster.ids)       # 更改细胞类型标注
DimPlot(SZDX0224_val, reduction = "tsne", label = T)
table(Idents(SZDX0224_val)) # 查看有多少个细胞
SZDX0224_val@meta.data[1:5, ]
SZDX0224_val$cell_cluster_origin <- Idents(SZDX0224_val)
SZDX0224_val@meta.data[1:5, ]
saveRDS(SZDX0224_val, file = "./Data/SZDX-0224_outs/SZDX0224_val.rds")

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04-01
<think>好的，用户想了解生物信息学中的主成分分析（PCA）的方法与应用。首先，我需要回忆PCA的基本原理，然后结合生物信息学的具体应用场景。根据提供的引用资料，PCA在基因组学、细胞学等领域有广泛应用，但要注意其局限性，比如非线性数据可能不适用。 用户可能想知道如何在生物信息学中实施PCA，包括步骤和注意事项。需要分步骤解释：数据预处理、协方差矩阵计算、特征分解、主成分选择、结果解释。同时，要提到生物信息学的具体例子，比如基因表达数据分析或种群遗传结构分析，这样用户能更直观理解。 还要注意用户提到的引用内容，特别是引用3和4，强调数据集成中的高效方法以及PCA的适用场景。可能需要提到使用软件如SPSS简化流程，但真正理解需要代码实现，不过用户可能更关注实际应用而非代码细节。 另外，用户可能关心PCA在生物信息学中的实际案例，比如降维后可视化样本间关系，或者去除批次效应。需要指出这些应用场景，并引用相关文献支持。 最后，考虑用户可能的问题，比如如何处理高维数据、与其他降维方法比较、结果解释的挑战等，确保回答全面且引导用户进一步思考。需要确保回答结构清晰，分点明确，引用正确，并自然融入参考资料中的信息。</think>### 生物信息学中的主成分分析（PCA）方法与应用 #### 一、PCA的核心原理 主成分分析（PCA）是一种线性降维方法，通过正交变换将原始高维数据映射到低维空间，保留最大方差的方向作为主成分。数学上，PCA通过计算协方差矩阵的特征值和特征向量，选择前$k$个最大特征值对应的特征向量作为主成分[^1]。 #### 二、生物信息学中的实施步骤 1. **数据预处理** - 标准化处理：基因表达数据通常需进行标准化（如$z$-score标准化），消除量纲差异[^2] - 缺失值处理：通过均值填补或插值方法解决基因测序数据中的缺失值问题 2. **协方差矩阵与特征分解** 对标准化后的数据矩阵$X$计算协方差矩阵$C = \frac{1}{n-1}X^TX$，并通过特征值分解获取主成分方向： $$ C = V\Lambda V^T $$ 其中$\Lambda$为特征值对角矩阵，$V$为特征向量矩阵 3. **主成分选择** 根据累计贡献率（如$\sum_{i=1}^k \lambda_i / \sum \lambda_i \geq 85\%$）确定保留主成分数量 #### 三、典型应用场景 1. **基因表达数据分析** - 可视化样本聚类：通过前2-3个主成分绘制散点图，识别癌症亚型或实验批次效应 - 案例：TCGA数据库中乳腺癌样本的分子分型分析[^3] 2. **种群遗传结构解析** - 利用SNP数据主成分分析欧亚人群迁徙历史 - 示例：千人基因组计划中群体遗传距离的可视化 3. **多组学数据整合** - 整合转录组、蛋白质组数据时进行维度压缩 - 注意：需先对异构数据进行联合标准化处理[^4] #### 四、注意事项与优化策略 1. **非线性关系处理** 当基因互作存在非线性特征时，可结合核PCA（Kernel PCA）或t-SNE方法 2. **高维小样本问题** 针对单细胞测序等高维数据（$p \gg n$），建议采用稀疏PCA（SPCA）增强解释性 3. **结果验证方法** - 通过置换检验评估主成分显著性 - 结合聚类稳定性分析（如轮廓系数） #### 五、与其他技术的对比 | 方法 | 适用场景 | 生物信息学案例 | |------------|-------------------------|------------------------------| | PCA | 线性关系/全局结构 | 基因表达谱降维 | | t-SNE | 局部结构/可视化 | 单细胞转录组可视化 | | UMAP | 保留拓扑结构 | 多组学数据整合 |
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