高通量筛选抗菌聚合物

视频文章用于医疗器械的高通量细菌排斥聚合物识别

摘要

医疗器械常与医院获得性感染相关，这些感染给患者和医疗系统带来巨大负担，并加剧抗菌素耐药性。减少器械相关感染的一种可能途径是为这些器械开发抗细菌聚合物涂层，以阻止细菌在初始附着阶段的结合。本文描述了一种基于微阵列并行筛选数百种聚合物来识别此类抗细菌聚合物的方法。该高通量方法成功识别出一系列能够抵抗多种临床相关细菌种类单独及多物种群落结合的有前景的聚合物。其中一种聚合物 PA13（聚（甲基丙烯酸甲酯‐共‐二甲基丙烯酰胺）），在涂覆于两种市售中心静脉导管后，显著降低了多种医院分离株的附着。所述方法可广泛应用于需要调控细菌附着的各类场景中聚合物的筛选。

引言

聚合物微阵列是一种微型化的高通量平台，可将多达7,000种聚合物1 打印到玻璃载片上，用于与原核或真核细胞 2进行并行分析。本文介绍的方法基于我们首次在2010 3中描述的方法。该筛选系统已应用于多种细胞类型，包括人肝细胞4 , 、干细胞 5 , 、肾小管上皮细胞 2 , 、细菌 3,6 和原生动物病原体7。在每种情况下，均鉴定出促进或抵抗研究细胞黏附的聚合物8。DNA与合成聚阳离子聚合物的复合物也已在微阵列格式中用于基因转染候选材料的高通量筛选9。除了用于细胞‐基底相互作用的筛选外，聚合物微阵列还被用于评估材料特性10。

合成聚合物调控细菌在表面附着的能力已被广泛证实3,6,11。已知多种因素，包括聚合物表面的电荷、疏水性和表面粗糙度，会影响细菌结合。传统上通过逐个或经验性地设计和测试一种材料来发现抗细菌结合生物材料的方法，是劳动密集型、昂贵且耗时的过程。聚合物微阵列为克服这些局限提供了一种有吸引力的替代方案。

表面附着的细菌以一种称为生物膜的复杂群落形式生长——这种生物膜对许多环境压力和抗生素具有高度抗性。这部分归因于其致密的胞外基质（由蛋白质、多糖和核酸组成）12 ，部分归因于生物膜中大量存在的强健“持留”细胞 13。尽管表面附着及后续生物膜形成的精确机制难以表征，但普遍认为表面生长可分为三个不同阶段14-16。首先是可逆附着，随后是细胞更强的黏附，接着通过产生胞外蛋白质和多糖基质以及细胞增殖形成生物膜。最后，成熟生物膜释放出游离的浮游细胞，这些细胞可在其他部位引发新的感染。能够阻止细菌初始附着从而防止生物膜形成早期阶段的细菌排斥性聚合物，可能是减少感染的理想解决方案。鉴于抗生素耐药性的上升（以及表面附着细菌本身更高的抗性）12，无抗生素方法在降低感染方面尤其受到关注。在医院环境中，细菌排斥性聚合物涂层可直接应用于减少医院获得性感染，这类感染通常发生在植入式器械周围17。

本文描述了一种高通量方法，用于筛选381种聚合物对与医院获得性感染相关的多种致病细菌的驱避活性，并进一步进行了命中验证以及对中心静脉导管材料的涂层和检测（图1）。简而言之，通过接触式打印将聚合物点样到琼脂糖包被玻片上，经过干燥和灭菌后，将微型阵列与临床重要细菌培养物共同孵育。孵育后，微阵列经轻柔洗涤，附着的细菌细胞通过荧光染色并进行观察。随后，选择能够抑制细菌结合的聚合物，在玻璃盖玻片上进行更大规模的涂层，并通过电子显微镜观察。最终，选定的具有驱避活性的聚合物被涂覆到商用导管上，结果显示其可使细菌附着减少近100倍。

实验方案

1. 琼脂糖有涂层的载玻片的制备

注意：在制备聚合物微阵列之前，需在氨基烷基硅烷包被玻片上涂覆琼脂糖I‐B，以最大限度减少非特异性背景结合，并便于评估能够结合或排斥细菌的聚合物6。硅烷涂层有助于琼脂糖与载玻片的结合。

1. 在250 ml瓶中配制2%（w/v）的琼脂糖I‐B蒸馏水溶液。
2. 将瓶盖松松盖上后，将悬浮液放入微波炉中，每次加热30秒，直至完全溶解。确保瓶盖不要拧紧，以避免可能的压力积聚。定期取出瓶子并轻轻旋转摇匀。
3. 确保固体已完全溶解且溶液澄清透明。将此琼脂糖溶液倒入100 ml烧杯中，并置于65°C水浴中以保持液态。
4. 将硅烷有涂层的载玻片浸入琼脂糖溶液中，确保形成均匀涂层，并用纸巾擦拭载玻片背面。
5. 将载玻片有涂层的一面朝上，置于无尘环境中（e.g.，柜子或通风橱内）干燥至少24小时。
6. 通过目视检查确认涂层均匀性。可通过向载玻片哈气来简便评估涂层情况——冷凝水会出现在无涂层区域。只有完全且均匀有涂层的载玻片可用于微阵列打印。

2. 打印用聚合物溶液的制备

1. 在玻璃小瓶中，将选定的预成型聚合物（包括聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚氨酯）溶于N‐甲基吡咯烷酮（NMP）中，配制成1% w/v的溶液。（每种聚合物配制1 ml）。涡旋混合至聚合物完全溶解。聚合物的合成方法见其他文献6。
2. 使用微量移液器，向384孔微孔板的每个孔中加入25微升聚合物溶液，确保无交叉污染，且每个孔含有唯一的聚合物。至少在2个孔中使用 NMP作为阴性对照。将每孔中聚合物溶液的身份记录在孔板模板或电子表格文件中。

3. 使用接触式打印机打印聚合物微阵列

注意：微阵列的打印使用接触式打印机进行。以下提供了关于聚合物微阵列打印的具体说明。有关打印机使用的通用指南和安全建议，请参照制造商的用户手册。尽管我们使用接触式打印机，但也可使用合适的手动打样装置。

1. 按照打印机用户手册中的建议，创建一个程序（参见步骤3.3），使用32针微阵列头（排列为8行4列），以四份重复的方式打印384种液体（聚合物溶液或NMP）。
2. 打印1536个点，排列为48行32列。编程程序以12个区域进行打印，i.e.，每次打印32种溶液，以便在每个区域打印完成后暂停打印机，进行针头清洗。
3. 创建打印程序：
4. 打开软件，从可用选项中选择“创建新程序”。选择“描述”选项卡以输入实验详情。选择“针头”选项卡，并选择“32针微阵列头”。
5. 选择“源”选项卡，并选择板架（源板架（1x5））、板类型（384孔×6,000型板）、总板数（1）和源顺序（按列）。
6. 在“载玻片设计”选项卡中，选择“3x1英寸载玻片”，并选择按“区域编号”进行排列。然后选择“排列模式”。将“点视图”设为“布局”，“图案尺寸”设为“行数”（6）、“列数”（8）、“行间距”（750）和“列间距”（560）。选择一个区域先进行打印。
7. 在“载玻片布局”选项卡中输入用于打印的载玻片数量。选择“打印”选项卡以输入打印参数（每次蘸取打印次数：1，每点打印次数：5，打印时间：200毫秒，蘸取时间：100毫秒）。
   注意：现在已创建一个使用32针微阵列头（排列为8行4列）将384种液体（聚合物溶液或NMP）以四份重复方式进行打印的程序。该程序总共应打印1536个点，排列为48行32列，行间距为750微米，列间距为560微米。
8. 将琼脂糖包被的载玻片放置在平台上，并确保有良好的真空密封以固定载玻片位置。
9. 调整打印头，使所有针头处于相同高度。通过手动将打印头降至玻璃载玻片上，确认所有针头同时上升来检查这一点。如果针头高度存在差异，请通过上下调节针头上的套管进行校正。
10. 将孔板以正确方向放置在板架上，i.e., A1孔位于板架的右上角，并确保孔板牢固固定。
11. 使用高度调节器，确保板架的高度合适，使得在吸取聚合物溶液时，针头不会触碰到孔底。注意：这对于均匀聚合物点样非常重要，同时可避免聚合物溶液溢出到相邻的孔中，从而引起交叉污染。
12. 选择“开始”选项卡，并将“运行类型”设置为“正常”。点击“运行”，并在提示时确认载玻片、孔板、etc.等已放置到位。
13. 每次打印1个区域（每次32种溶液；共12个区域），并在各区域之间对针头进行清洗。用浸有丙酮的纸巾彻底清洗针头，然后用干燥的纸巾擦拭，以确保针头完全干燥。
14. 微阵列打印完成后，将其放入载玻片架中，并在45°C的真空烘箱中过夜干燥以去除聚合物点样中的NMP。经紫外光灭菌30分钟后，微阵列即可用于细菌接种。
15. 在用细菌接种载玻片之前，测量背景荧光（如第5节所述）。使用此测量值 i 在细菌结合的计算中。

4. 聚合物微阵列的细菌接种

注意：确保采用无菌技术。所有培养物的操作都应在无菌环境中进行：可使用本生灯或在超净工作台内操作。培养物的培养应根据每个物种的需求调整氧气供应、培养基和温度。

1. 通过接种5 ml LB肉汤（LB：每升含10 g胰蛋白胨、5 g氯化钠和10 g酵母提取物）制备过夜培养物，将接种物加入其中从平板上挑取单菌落，在37 °C下以200 rpm振荡培养过夜。
2. 将甘油加入过夜培养物中（终浓度为10%），制备冷冻保存菌种，并于‐80°C 保存。
3. 为了确定解冻的细菌菌种样品中的细胞数量，对每种菌种进行系列稀释，并在固体培养基上过夜培养细菌。准确测定菌种中的细胞数量可确保每种细菌的接种量适当6。
4. 制备微阵列接种物。单一物种培养按上述方法培养后直接用于微阵列。BacMix‐1是由Klebsiella pneumoniae(K. pneumoniae)、 Staphylococcus saprophyticus(S. saprophyticus)和 Staphylococcus aureus(S.aureus)组成的细菌混合物。BacMix‐2是由Streptococcus mutans(S. mutans)、 S. aureus、 K. pneumoniae和 Enterococcus faecalis(E. faecalis)组成的细菌混合物。
5. 为制备任一混合培养物，将过夜培养物等体积混合（各3 ml），并用新鲜LB培养基稀释四倍（最终体积约50 ml）。
6. 将经紫外线灭菌的聚合物微阵列放入矩形4孔板中，加入6 ml混合细菌培养物，在37 °C下以轻微振荡（30 rpm）孵育5天。
7. 孵育后，用磷酸盐缓冲液（PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4, 1，8 mM KH2PO4）轻轻冲洗微阵列两次，随后在PBS中加入含1 μg ml-1 4’,6‐二脒基‐2‐苯基吲哚（DAPI）染料的溶液，避光染色30分钟。
8. 将染色后的微阵列载玻片置于新的孔板中，加入PBS覆盖并轻轻旋转洗涤一次，更换PBS后再洗涤一次，然后在气流下干燥空气。将玻璃盖玻片盖在微阵列载玻片上，并用胶水密封固定。干燥后，用70%（体积/体积）乙醇对表面进行灭菌。
9. 根据培养物的防护等级安全处理废弃培养物。

5. 微阵列成像与分析

1. 在明场和DAPI（激发/发射 = 358 nm / 361 nm）通道中，为每个聚合物点样拍摄单张图像。可通过荧光显微镜手动完成，或使用配备20倍物镜的自动荧光显微镜（由图像采集软件控制的X‐Y‐Z平台）进行。注意：请参阅操作手册18 ，了解如何运行软件并调节显微镜以获取明场和DAPI 通道的图像。确保所有微阵列图像采集时的增益和曝光时间保持一致。
2. 通过选择点区域并使用图像处理软件量化荧光，获得DAPI通道中每个点样的平均荧光强度。
3. 对于每个点样的背景荧光，获取仅用培养基（不含细菌）孵育的重复微阵列上聚合物点样的图像。从点样强度中减去背景荧光，得到来自细菌的荧光信号。
4. 计算代表每种聚合物的四个点样的平均归一化值，用于比较不同聚合物的细菌结合情况6。
5. 将表现出最少细菌结合（荧光强度最低）的聚合物确定为“命中”聚合物6。

6. 用于“命中”验证的盖玻片涂层

1. 用聚合物包被盖玻片：

1. 配制“命中”聚合物（~2% w/v）在四氢呋喃（THF）或其他合适溶剂中的溶液。
2. 使用旋涂仪以2,000转/分钟的速度对适当尺寸的圆形玻璃盖玻片进行旋涂，涂覆聚合物溶液，持续10秒。
   注意：若无旋涂仪，可采用浸涂法对盖玻片或其他材料进行涂层，但旋涂可获得更均匀的表面。
3. 将有涂层的盖玻片置于40°C对流烘箱中过夜干燥，并在接种细菌前用紫外光灭菌30分钟。

2. 用于阴性对照的盖玻片琼脂糖包被：

1. 通过等离子体处理10分钟或在1M氢氧化钠中浸泡4小时来清洁盖玻片。
2. 将盖玻片浸入含有1%（3‐氨丙基）三乙氧基硅烷的乙腈中过夜。用丙酮清洗盖玻片3次，并置于烘箱中（100°C）加热1小时。
3. 将干燥的盖玻片浸涂于保持在60°C水浴中的1%琼脂糖水溶液。将有涂层的琼脂糖盖玻片放置在无尘环境下的平坦表面静置24小时，并在接种细菌前用紫外光灭菌30分钟。

7. 使用扫描电子显微镜（SEM）对盖玻片进行附着和分析

1. 经紫外光灭菌30分钟后，将盖玻片（聚合物/琼脂糖涂层或未涂层玻璃）放入标准的12孔板或24孔板中（根据盖玻片的大小而定），并按照第4节所述与细菌共培养。
2. 与细菌孵育后，用0.1 M卡可基酸盐缓冲液（pH 7.4）将无涂层和有涂层的盖玻片各清洗两次，然后在0.1 M卡可基酸盐缓冲液（pH 7.4）中加入 2.5%（w/v）戊二醛固定2小时。
3. 在室温下用1%（w/v）四氧化锇对样品进行后固定处理1小时，并依次用50%、70%、90%和100%（v/v）乙醇溶液洗涤，每次30分钟，进行脱水处理。
4. 根据标准方案19使用CO2干燥样品。干燥时间取决于样品性质。
5. 使用溅射镀膜仪，在30 mA电流和0.75 Torr真空条件下，用金/钯合金（60/40%）对样品进行镀膜。按照标准方案20在电子显微镜下观察样品。
   注意：四氧化锇具有高毒性，必须采取充分的安全防护措施，以管理其储存、操作和处置过程中的风险。
6. 视觉上比较无涂层盖玻片以及琼脂糖或“命中”聚合物涂层盖玻片的图像，以确认聚合物的细菌结合/排斥能力。
   注意：抗附着性应表现为存在的细胞数量明显减少，易于观察。
7. 选择最具潜力的“命中”非结合性聚合物，用于医疗器械（e.g.，中心静脉导管）的涂层研究6。

8. 导管涂层溶剂的选择

1. 评估各种溶剂与导管留置部分的相容性，以及其溶解“命中”聚合物的能力。将cath‐1切割成长度为5 mm的圆柱形片段，并使用数字游标卡尺进行测量。
2. 评估各种溶剂，如乙酸、氨、丙酮、乙腈、乙醚、四氢呋喃（THF）、二甲基甲酰胺(DMF)、N‐甲基‐2‐吡咯烷酮（NMP）、乙醇、甲醇、乙二醇、甲苯和二甲苯。将导管片段浸入溶剂中12小时，视觉上评估导管的完整性和溶剂的澄清度。
   注意：选择一种不会导致导管膨胀或分解或产生浑浊溶剂的溶剂。该溶剂必须能够溶解“命中”聚合物

9. 通过共聚焦显微镜分析导管上的细菌附着

1. 在丙酮或其他根据第8节确定的合适溶剂中配制2.5% (w/v) 聚合物溶液。将5 mm导管片段放入小玻璃小瓶（5 ml）中，加入1 ml聚合物溶液浸泡2分钟。去除多余的聚合物溶液，并将导管干燥在40 °C的真空烘箱中过夜干燥片段。
2. 通过混合解冻的细菌菌种制备接种物，使每种物种在50 ml LB6中约含有10 6 个细胞。
3. 用紫外光对带涂层和无涂层导管部件进行30分钟的灭菌处理，然后在24孔板中以1 ml接种的LB培养基于37 °C孵育3天，并轻轻震荡6。
4. 孵育后，用PBS（2次，每次2 ml）清洗导管，再用PBS中的10%多聚甲醛固定细菌30分钟，随后用PBS（1 ml）清洗。用DAPI（1 μg ml−1）染色导管片段上的细菌20分钟，并用PBS（1 ml）清洗。
5. 使用以下设置获取导管片段的共聚焦图像：405nm蓝色二极管激光，检测器范围414至502 nm，针孔‐艾里1，图像大小‐1,024 × 1,024像素，体素宽度‐105.2 nm，Z堆栈间距0.5μm，放大倍数‐40X 1.25。
6. 在导管100 μm长度范围内进行Z堆栈50幅图像完成共聚焦成像。
7. 使用合适的分析软件分析图像：在Z平面使用扩展景深功能展平Z堆栈图像，生成单个导管片段的图像。注意：此图像应经过‘展平背景’功能进行背景校正后，进一步分析以获得被细菌覆盖的导管面积。

10. 通过扫描电镜观察细菌在导管上的附着分析

1. 在丙酮中配制10%聚合物溶液(w/v)。
2. 将200 μl微量移液器的移液器吸头压入导管切割段的中部以固定导管，然后将其浸入聚合物溶液中约 30秒。在常温环境下干燥有涂层的导管段30分钟。再次浸入聚合物溶液进行第二层涂覆，并在常温环境下过夜干燥。
3. 经紫外线处理并与细菌孵育后，用PBS（2次，每次1 ml）清洗导管段（n = 3），然后将其转移至含有PBS中的10%甲醛的48孔板中，固定30分钟。固定后，用PBS（1 ml）清洗导管段，在室温下过夜干燥，使用导电碳盘将样品固定在载台上，并用溅射镀膜仪进行金镀层（见步骤7.5）。
4. 使用扫描电子显微镜6获取图像。

视频文章用于医疗器械的高通量细菌排斥聚合物识别

代表性结果

图2显示了通过微阵列分析确定的多种聚合物上的细菌附着（归一化荧光强度）。未打印聚合物的斑点（仅NMP）作为阴性对照，因为琼脂糖强烈抵抗细菌结合6 ——记录的荧光非常低。所示聚合物均为低结合，但在大多数情况下，不同测试细菌种类之间的聚合物抗粘附性能存在显著差异。这反映了不同物种间附着机制的巨大差异。因此，合适聚合物的选择取决于具体应用，但低结合聚合物可通过与琼脂糖比较而轻松识别。高结合聚合物可能在阵列中被识别出来，并可用作后续实验的阳性对照。对于在DAPI通道中不显示自发荧光的聚合物，可视觉上对斑点图像进行定性比较（如图3所示，突出显示一个代表性高结合聚合物和三个低结合聚合物示例）。这种比较虽然提供的信息少于统计分析，但可作为计算的强度值的有效视觉验证。

通过微阵列识别出22种合适的聚合物后，进行了放大实验，以确认其在较大表面涂层应用中的抗细菌粘附性能。图中展示了表现最佳的示例，用于涂覆玻璃盖玻片（通过扫描电子显微镜分析（图4和5））和导管切片（通过共聚焦显微镜（图6）和扫描电子显微镜（图7）分析）。这两种显微技术均能实现对表面进行直接细胞计数，提供明确的数据；细胞粘附的减少清晰可见。那些在放大后仍能较好保持抗粘附性能且适用于大规模涂层技术的涂层被进一步研究。所示结果展示了各阶段表现最佳的聚合物。

与涂覆PA13的导管(B)在与含有 BacMix‐2的细菌混合液孵育后的对比情况。比例尺 = 10微米。改编自参考文献 6。)

聚合物	单体1	单体2	单体3	单体比例	单体比例	单体比例
PA465	MEMA	DEAEMA	HEA	8	1	1
PA475	MEMA	DEAEA	HEMA	6	1	3
PA513	MEMA	DEAEMA	MMA	8	1	1
PA515	MEMA	DEAEA	MMA	6	1	3
PA13	MMA	DMAA	-	9	1	-
PU1	聚乙二醇2000	HDI	-	4.9	5.2	-
PU16	聚乙二醇2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU161	聚乙二醇2000	MDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU7	PEG900	BICH	-	4.9	5.2	-
PU83	PEG900	HMDI	BD	2.5	5.2	2.3
聚氨酯 227	聚丙二醇‐聚乙二醇‐1900	HDI	-	4.9	5.2	-
聚氨酯 129	聚丙二醇425	BICH	二甲氨基丙胺	2.5	5.2	2.3
PU10	聚四氢呋喃2000	BICH	-	4.9	5.2	-
聚氨酯 179	PTMG2000	HDI	NMAPD	2.5	5.2	2.3
PU20	PTMG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU5	PTMG2000	HDI	-	4.9	5.2	-

表1：图2中细菌非结合‘命中’聚合物的组成。

讨论

细菌在表面的附着是一个复杂的过程，受多种因素影响，包括细菌种类、表面特性、周围介质和物理环境。尽管已知某些化学基团会影响细菌结合（例如聚乙二醇通常具有抗附着性11），但将聚合物的生物效应与其化学结构相关联仍然困难，这使得针对特定功能的聚合物理性设计充满挑战。在缺乏详细附着机制的情况下，其他研究尝试模仿天然存在的抗粘附表面，但往往需要漫长而广泛的优化过程21。本文介绍的微型高通量方法通过并行筛选数百种聚合物，促进了先导材料的发现，从而克服了这些挑战。

微阵列方法的结果主要用于识别潜在的候选先导材料。图2展示了22种对至少一种物种具有低结合特性的候选材料，而图3则显示了结合能力的显著降低。在图2中所示的22种低结合聚合物均被推进至放大实验，在实验中确定出在抗粘附性和涂层性能方面表现最佳的材料为PU83、 PA13和PA515（图4和图5）。由于聚丙烯酸酯在聚合方法上具有更高的灵活性，因此选择了结合性最低的聚丙烯酸酯PA13用于导管涂层研究 （图6和图7）。其他候选材料的更详细研究工作也已开展，并已在别处报道6。

经过多次实验迭代，我们发现一些小的步骤对成功和可重复性至关重要。使用琼脂糖底层涂层不仅有助于聚合物在玻璃载片上的粘附，还能提供干净的背景，因为琼脂糖对细菌定植具有高度抗性。同样，聚合物点样在同一个微阵列内以及不同微阵列之间的一致性也极为重要，因此必须严格控制微阵列的打印过程。需要仔细调整打印头中的针头，并均匀填充384孔板，以确保点样的均匀性。由于我们使用的某些聚合物表现出一定程度的自发荧光，因此在与细菌孵育前获取每张载玻片的背景荧光数据至关重要。为了消除变异并获得可靠的数据，建议进行微阵列重复实验。

此处使用的染料（DAPI）对细菌种类无选择性，会非特异性地结合DNA。因此，在引入细菌培养物后，必须严格遵守无菌技术，因为污染物可能无法被察觉，从而干扰结果的解读。对于后续使用扫描电子显微镜的实验也是如此，因为只能区分杆菌和球菌，而无法区分属或种。

经过微阵列筛选后，应选择有前景的聚合物进行进一步验证。在此处展示的示例中，通过微阵列上荧光明显降低识别出七种感兴趣的聚合物，并通过在较大表面上涂覆涂层来确认其对附着的抑制作用。图4 和5显示了在玻璃盖片上实现的结合减少情况，这是一种测试聚合物作为块体涂层而非微阵列斑点行为的实际方法。随后，将这些聚合物涂覆到医疗器械上，以全面量化细菌附着的减少。重要的是，为这些涂覆研究选择的溶剂 （参见方案第8部分）应对目标基底（此处为导管）无害，同时仍具有溶解目标聚合物的能力，以便实现涂覆。此处我们使用了丙酮，除了上述特性外，丙酮还具有低沸点，能快速蒸发，留下均匀的涂层。

所选择的验证方法将取决于正在研究的具体应用。由于通过电子显微镜和荧光显微镜观察细胞可以直接量化单个细胞的附着情况，因此我们选择这些技术作为整体染色微阵列检测的补充。结果如图6和7所示，表明了互补验证方法的重要性。图6中的共聚焦图像提供了单个细胞的非常清晰的图像，而扫描电子显微镜（SEM）还有一个额外优点，即可对聚合物表面进行评估，此处表面光滑且均匀。这些方法受限于所用显微镜的视野，因此拍摄一系列快照以确保结果的可靠性非常重要。上述方法无法对整个表面的细菌黏附进行定量，只能从小范围区域推断覆盖情况。我们认为这对于所述应用已足够。可通过使用其他地方描述的方法22，对整个带涂层和无涂层导管部件上表面附着的细菌进行计数，从而评估细菌结合的减少情况。然而，此类方法要求被筛选的生物材料表面具有均匀表面积，而在对通常具有复杂几何结构的医疗器械进行检测时，很难保持这一点。

显然，任何用于临床应用的器械都必须经过大量进一步测试，以确保其在人体中的安全性和有效性。本文介绍的方法仅是这一过程的开端，后续工作必须包括对in vivo活性的验证。以静脉导管为例，初步工作可研究血液成分和完整细胞与聚合物的结合情况。还应考虑血液成分对细菌结合的影响，可能需要在灭活血清或去纤维蛋白血存在的条件下重复结合实验23。该技术的最终验证将在in vivo模型中进行，例如皮下植入感染模型24。

我们展示了聚合物微阵列方法在筛选表面改性聚合物方面的潜力。这类聚合物（包括抵抗和促进细菌结合的聚合物）在医学、食品工业和生物技术领域具有广泛的应用，意味着该方法可能在多个研究领域中具有实用价值。尽管本研究使用了细菌，但该方法也可适用于其他细胞类型，同样可推广至其他化学微阵列。